Funcionalidad de la lactoferrina y galactooligosacáridos en fórmulas infantiles

Resum

Las fórmulas infantiles desempeñan un papel indispensable sobre todo después de 4 a 6 meses de vida de un recién nacido ya que la leche materna ya no es suficiente para satisfacer todas las necesidades nutricionales a esta edad. Aunque las fórmulas infantiles deben ser similares a la leche materna madura en términos de sus macronutrientes y micronutrientes, por lo general no tienen, ni cualitativa ni cuantitativamente, los ingredientes funcionales que se encuentran en la leche humana, ni tienen la misma composición de proteínas y la diversidad de oligosacáridos de la leche materna. Por lo tanto, es muy importante agregar estos ingredientes de las fórmulas infantiles. La evolución en la composición las fórmulas infantiles con mejoras en sus procesos de fabricación permiten ejercer más efectos positivos en un grupo grande de los recién nacidos que no pueden ser alimentados con leche materna como fuente primaria por distintas causas. Por lo tanto, el objetivo del presente estudio ha sido evaluar la funcionalidad de lactoferrina humana recombinante (rhLf), hidrolizada de rhLf y GOS en las fórmulas infantiles. A este fin, el estudio se dividió en cuatro experimentos: 1. Objetivos de la tesis 1. Evaluación in vitro de la biodisponibilidad del hierro de las fórmulas infantiles suplementadas con diferentes concentraciones de rhLf y/o GOS, usando la cantidad de ferritina sintetizados por las células Caco-2 como criterio. 2. Evaluación in vitro del efecto anti-inflamatorio de diferentes concentraciones de rhLf y el hidrolizado de rhLf. 3. Evaluación in vitro de la actividad prebiótica de rhLf y/o GOS. 4. Evaluación in vitro del efecto de la digestión simulada in vitro sobre la fraccionación de rhLf y el perfil de los ácidos grasos de cadena larga (LCFAs). 2. Metodolgía 1. Diseño de fórmulas infantiles con la suplementación de rhLf y/o GOS con leche materna madura como un modelo. 2. En la digestión simulada in vitro de muestras suplementadas con diferentes concentraciones de rhLf y/o GOS para determinar la (bio)-disponibilidad del hierro de fórmula infantil mediante células Caco-2 (Frontela et al., 2009). Un kit de ELISA se usa para cuantificar la ferritina formada por las células la que se utiliza como un criterio de la disponibilidad de hierro. 3. En la digestión simulada in vitro de las muestras, los digeridos obtenidos se guardaron para investigar el efecto in vitro de la digestión sobre la fraccionación de rhLf y el perfil de los ácidos grasos de cadena larga mediante el análisis de western blot, HPLC-masas y GC. 4. Para investigar los efectos anti-inflamatorios de rhLf y el hidrolizado de rhLf, se utilizaron dos tipos de células Caco-2 y RAW 264.700 (Tanoue et al., 2008) y con el estímulo de las células de RAW 264.700 por el lipopolisacárido (LPS) (de la Escherichia coli). En este modelo, el efecto del LPS en la monocapa de células y el efecto anti-inflamatorio de rhLf y el hidrolizado de rhLf pueden visualizarse utilizando la determinación de algunos parámetros: TEER, ROS, IL-8 y NO. 5. Para investigar el efecto prebiótico de rhLf y/o GOS mediante cultivos por lotes utilizando como sistema de fermentación, se midieron algunos parámetros como el pH y los ácidos grasos de cadena corta. 3. Conclusiones y trabajo del futuro 1. Además de los transportadores específicos de hierro hemo y no-hemo para la absorción de hierro en las células duodenales, se ha demostrado que rhLf tiene un sitio específico para la absorción de formas ferrosos y férricos de hierro. Los resultados obtenidos del estudio llevado a cabo con células Caco-2 modelo confirmó la importancia de la suplementación de las fórmulas infantiles con Lf y GOS que llevó a aumentar ferritina formada por los cultivos celulares. Los resultados confirmaron que la solubilidad no es el único factor correlacionado con la mejora de la biodisponibilidad del hierro, por lo tanto, es útil investigar el papel de algunos genes relacionados con la biodisponibilidad del hierro como DMT1. 2. rhLf y su hidrolizado ejercen su actividad anti-inflamatoria a través de su capacidad para unirse a LPS y posteriormente modular la producción de citoquinas. El mecanismo de acción de Lf también depende en gran medida de su capacidad para influir en las respuestas tempranas, incluyendo la modulación de la producción de ROS intracelular. La actividad anti-inflamatoria de rhLf y el hidrolizado de rhLf, esta última se ha mostrado más eficaz y es considerado como un destacado agente terapéutico que se debe tener en cuenta durante el diseño de las fórmulas infantiles. 3. Los resultados del estudio llevado a cabo con cultivos por lotes utilizando como sistema de fermentación ha mostrado que tanto la rhLf y/o GOS influyen en la obtención de productos finales de fermentación como los ácidos grasos de cadena corta, este proceso fermentativo además lleva a la disminución de bacterias patógenas y de forma complementaria el incremento de las bacterias bifidogénicas. 4. Los resultados obtenidos confirmaron que rhLf es más estable que Lf humana, por lo que se considera un factor importante para la suplementación de las fórmulas infantiles. Aunque se necesitan estudios complementarios para descubrir y detectar esta característica, los resultados propuestos un papel de GOS a proteger Lf contra las enzimas digestivas. Del mismo modo, los resultados obtenidos confirman la importancia de la lactancia materna relacionada a los ácidos grasos liberados por la digestión. 5. En conjunto, los resultados obtenidos confirman y apoyan la urgente necesidad de suplementación con Lf y/o GOS de las fórmulas infantiles. Los resultados demostraron la importancia del hidrolizado de rhLf como un nuevo aditivo y puede ser en un futuro próximo nuevas fórmulas contienen el hidrolizado de rhLf será visto en los mercados. Tesis Doctoral: Funcionalidad de la lactoferrina y galactooligosacáridos en fórmulas infantiles. 2015. Autor: Esmat Aly Alsayed Aly. Directores: Dr. Gaspar Ros Berruezo, Dr. Carmen Frontela-Saseta. Universidad de Murcia Infant formulas, as milk substitute, play an indispensable role especially after 4-6 months of infant life where human milk is no longer sufficient to meet all necessary nutritional requirements. Although infant formulas should be similar to mature human milk in terms of its macronutrients and micronutrients, normally it do not have the functional ingredients that are found in human milk, nor do they have the same protein composition and the diversity of oligosaccharides as human milk. So it is critically important adding these ingredients to infant formulas. This evolution of infant formulas manufacturing allow to exert more functionalities in a large group of infants who cannot feed human milk as a primary source and for several physiological as well as social reasons. For mimicking the structure of human milk, galactooligosaccharides (GOS, as prebiotic) and recombinant human lactoferrin (rhLf) are strongly added to infant formulas to obtain similar functionalities for what human milk has. Thus, the present study is aimed to explore the functionality of rhLf, rhLf hydrolysate and GOS whether alone or added in infant formulas. The present study is divided into four experiments: 1. Objectives of the PhD Thesis 1. In vitro assessment of the bioavailability of iron from infant formulas supplemented with different concentrations of rhLf and/or GOS, using the amount of ferritin synthesized as criteria 2. In vitro evaluation of the anti-inflammatory effect of different concentrations of rhLf and rhLf hydrolysate. 3. In vitro evaluation of the prebiotic activity of rhLf and/or GOS. 4. In vitro evaluation of the effect of simulated gastrointestinal digestion on the added rhLf fractionation and long chain fatty acids (LCFAs) profile. 2. Methodology 1. Design of infant formulas with the supplementation of rhLf and/or GOS with mature human milk as a model. 2. In the in vitro simulated digestion of samples supplemented with different concentrations of rhLf and/or GOS aimed to determine the (bio)-availability of iron of infant formula by using Caco-2cell model (Frontela et al., 2009). An ELISA kit for the analysis of ferritin formed by the cells which is used as a criterion of the availability of iron. 3. In the in vitro simulated digestion of supplemented samples, the digests were kept to investigate the effect of the in vitro digestion on the fractionation of rhLf and the profile of the long-chain fatty acids by using the western blot, HPLC-mass and GC. 4. To investigate the anti-inflammatory effects of rhLf and rhLf hydrolysate, it were used two types of cells are Caco-2 and RAW 264.7 (Tanoue et al., 2008) and with the stimulation of the RAW 264.7 cells by lipopolysaccharide (LPS) (from Escherichia coli). In this model, the effect of LPS on the monolayer of cells and the anti-inflammatory effect of rhLf and rhLf hydrolysate and can be viewed using the extent of some parameters: TEER, ROS, IL-8 and NO. 5. To investigate the prebiotic effect of rhLf and/or GOS by using batch fermentation culture system, some parameters were measured as pH and short-chain fatty acids. 3. Conclusions and future work 1. Beside heme and non-heme specific transporters for the absorption of iron in duodenal cells, it has been proved that rhLf has a specific site for the absorption of ferrous and ferric forms of iron. The obtained results of the study carried out using Caco-2 cell model confirmed the importance of the supplementation of infant formulas with rhLf and GOS where it led to increase ferritin formed by cell cultures. The results confirmed that solubility is not the only factor correlated with improvement of iron bioavailability, therefore it is useful investigate the role of some genes related with iron bioavailability such as rhLf hydrolysate exert their anti-inflammatory activity through its ability to bind LPS and subsequently modulate cytokine production. The mechanism of Lf's action is also largely dependent on its ability to influence early responses, including the modulation of intracellular ROS production. Between rhLf and rhLf hydrolysate, rhLf is more effective and is considered a prominent therapeutic agent, which must to be taken into account during infant formulas design. 2. The results of study carried out using batch culture fermentation system proposed that rhLf and/or GOS influenced the fermentation end products such as SCFAs. This fermentation process lead to a decreasing of the pathogenic bacteria and complementary an increase of the bifidogenic ones. 3. The obtained results confirmed that rhLf is more stable than human Lf and thus it is considered a prominent factor for infant formulas supplementation. Although many studies are needed to discover this characteristic, the results proposed a role for GOS in protect rhLf against the digestive enzymes. Likewise, the results confirmed the importance of the breastfeeding pattern concerning with the released free fatty acids by digestion. 4. Overall, the obtained findings confirm and support the urgently need to supplementation with rhLf and/or GOS of infant formulas. The results demonstrated the importance of the hydrolysate of human recombinant lactoferrin as a new additive and may be in the near future new formulas contain the hydrolysate of rhLf will be seen in the markets.