Anti-regurgitation infant formulasin-vitro study about the effect of different thickering ingredients on their physicochemical characteristics across a digstive process, mineral availability and infant microbiota

Resumen

Pese a ser un proceso considerado fisiológico, la regurgitación en lactantes es una causa frecuente de consulta pediátrica. En casos no complicados, se recomienda la terapia postural y nutricional, dentro de la cual se incluyen la fórmulas anti-reflujo (AR). Estas fórmulas están especialmente formuladas con ingredientes espesantes para dificultar el reflujo al esófago. La presente tesis doctoral tiene como objetivo estudiar el efecto de un proceso de digestión in-vitro aplicado a tres ingredientes espesantes: harina de algarrobo (LBG), fosfato de almidon de maíz hidroxipropilado (Mhdp) y almidón pregelatinizado de arroz (gRS); sobre sus características fisicoquímicas, así como su posible relación con la disponibilidad in-vitro de Ca, Fe y Zn, y el efecto sobre la microbiota fecal del lactante. Con este objetivo, esta tesis ha sido dividida en tres capítulos. En el primero de ellos, se aborda el estudio de digestión in-vitro sobre diferentes características fisicoquímicas de una disolución de cada uno de los ingredientes espesantes en agua desionizada. Se analizaron cantidad aparente de ingrediente solubilizada (mediante deshidratación y gravimetría), viscosidad dinámica relativa y propiedades moleculares (Fraccionamiento en Flujo mediante Campo de Flujo Asimétrico, AF4), en diferentes tiempos de un proceso digestivo in-vitro (antes de la digestión, tras la digestión gástrica y tras la digestión intestinal). En el segundo capítulo, se analizó la disponibilidad mineral de Ca, Fe y Zn, en una fórmula infantil base, a la cual se le adicionaron ingredientes espesantes (LBG, Mhdp y gRS). Para la determinación de la disponibilidad mineral se llevó acabo un proceso de digestión in-vitro, tras el cual se analizó el contenido mineral en la fracción soluble y dializable intestinal. Junto a ello, se analizó el transporte y captación mineral en un cultivo celular de células de carcinoma de colon humano (Caco-2), así como la expresión génica de transportadores implicados en su transporte y almacenamiento celular. Por último, el tercer capítulo de la tesis aborda el efecto cada uno de los ingredientes sobre la microbiota fecal del lactante. Con esta finalidad se llevó a cabo un ensayo de fermentación in-vitro, empleando como referencia prebiótica positiva y negativa, inulina y D-glucosa, respectivamente. Durante un período de 48 horas, se terminó la evolución de pH, así como la producción propionato, butirato y acetato, junto al la cuantificación de diferentes grupos microbianos de relevancia en la microbiota intestinal del lactante por qPCR. Las conclusiones extraídas del estudio fueron que la adición de LBG como agente espesante resulta en una viscosidad mayor que la proporcionada por los almidones modificados (Mhdp y gRS), siendo resistente al proceso digestivo in-vitro. En este sentido, mientras que LBG disminuye la solubilidad y dializabilidad de Ca, Fe y Zn, Mhdp y gRS sólo afectan a la disponibilidad de Ca. Estos efectos son extensibles a la retención mineral por cultivos de células Caco-2, pero no a la absorción o eficiencia de su transporte, sin efecto sobre las moléculas de los transportadores de minerales celulares. Atendiendo a su fermentabilidad, LBG puede definirse como un "ingrediente de fermentación lenta", dando como resultado una moderada producción de gas, una caída moderada del pH, así como una relación decreciente de acetato: propionato. Estas propiedades están relacionadas con el desarrollo de una microbiota fecal variada. Por el contrario, los almidones modificados, Mhdp y gRS se clasifican como "ingredientes de fermentación rápida", dando como resultado una gran producción de gas, una caída repentina del pH y una producción mayoritaria de acetato. Estas propiedades promueven el desarrollo de una microbiota fecal menos variada. Despite being considered a physiological process, regurgitation in infants is a frequent cause of paediatric consultation. In uncomplicated cases, postural and nutritional therapy are recommended, which includes anti-reflux (AR) formulas. These formulas are specially formulated with thickening ingredients to avoid reflux of gastric content to the esophagus. The present thesis aims to study the effect of an in-vitro digestion process applied to three thickening ingredients: locust bean flour (LBG), hydroxypropylated maize starch phosphate (Mhdp) and pregelatinized rice starch (gRS); on its physico-chemical characteristics, as well as its possible relation with the in-vitro availability of Ca, Fe and Zn, and the effect on the fecal microbiota of the infant. With this aim, this thesis has been divided into three chapters. In the first one, the study of in-vitro digestion on different physicochemical characteristics of each thickening ingredient aqueous solution was conducted. Apparent amount of solubilized ingredient (by dehydration and gravimetry), relative dynamic viscosity and molecular properties (Flow Fractionation by Asymmetric Flow Field, AF4), were analysed at different times of an in-vitro digestive process (before digestion, after digestion, gastric digestion and intestinal digestion). In the second chapter, determination of the mineral availability of Ca, Fe and Zn was performed in a basic infant formula, mixed with thickening ingredients (LBG, Mhdp and gRS). To determine the mineral availability, an in-vitro digestion process was carried out, after which the mineral content in the soluble and dialyzable intestinal fraction was analysed. In addition, transport and mineral uptake in a cell culture of human colon carcinoma cells (Caco-2), as well as the gene expression of transporters involved in their transport and storage were analysed. Finally, the third chapter addresses the effect each of the ingredients on infant faecal microbiota. For this purpose, an in-vitro fermentation test was carried out, using inulin and D-glucose as positive and negative prebiotic reference, respectively. During a 48-hour period, the evolution of pH, as well as the production of propionate, butyrate and acetate, was determined, together with the quantification of different microbial groups of relevance in the intestinal microbiota of the infant by qPCR. The conclusions drawn from the study were that the addition of LBG as thickening agent results in a greater viscosity than that provided by modified starches (Mhdp and gRS), being resistant to the in-vitro digestive process. In this sense, while LBG decreases the solubility and dialysability of Ca, Fe and Zn, Mhdp and gRS only affect the availability of Ca. These effects extend to mineral retention by Caco-2 cell cultures, but not to the absorption or efficiency of its transport, without effect on cellular mineral carriers and storage proteins. Due to its fermentability, LBG can be defined as a "slow fermentation ingredient", resulting in moderate gas production, a moderate pH drop, as well as a decreasing ratio of acetate : propionate. These properties are related to the development of a varied faecal microbiota. In contrast, modified starches, Mhdp and gRS are classified as "fast fermenting ingredients", resulting in large gas production, a sudden drop in pH and a majority production of acetate. These properties promote the development of a less varied faecal microbiota.