Técnicas miniaturizadas de tratamiento de muestra para el análisis dirigido y no dirigido de fluidos biológicos humanos

Resumen

El desarrollo de un nuevo método analítico implica numerosas etapas. De ellas, el tratamiento de la muestra es la más compleja a la vez que decisiva para el éxito del método. Por ello, la investigación en el campo de la Química Analítica se centra en el desarrollo de técnicas miniaturizadas de preparación de muestra que, además de simplificar la matriz y preconcentrar los analitos, van en consonancia con los principios de la Química Analítica Verde. Los procesos miniaturizados han dado lugar a las técnicas conocidas como técnicas de microextracción que permiten la extracción y concentración de los analitos tanto en fases líquidas como sólidas, utilizando cantidades de fase extractante del orden de los microlitros o microgramos. Los métodos analíticos desarrollados en esta Tesis Doctoral se basan en procedimientos de microextracción, tanto en fase líquida como en fase sólida magnética, y han permitido mejorar la sensibilidad de los métodos propuestos en comparación con la aplicación de metodologías convencionales. La detección de los analitos una vez separados se ha llevado a cabo utilizando HRMS, concretamente la combinación híbrida de analizadores tipo cuadrupolo y tiempo de vuelo (Q-TOF), que permite no solo la identificación y cuantificación de los analitos estudiados en análisis dirigido, sino que también posibilita ampliar la búsqueda de otras especies químicas al llevar a cabo el análisis desde un enfoque no dirigido. Así, aplicando las mismas condiciones experimentales optimizadas para análisis dirigido, se ha estudiado la presencia de posibles metabolitos y compuestos relacionados con los analitos objeto de estudio. Los métodos analíticos desarrollados en esta Tesis Doctoral se centran en el análisis de protoalcaloides en muestras biológicas de origen humano, concretamente orina y suero. En ambos tipos de muestra es posible detectar un gran número de compuestos orgánicos que proporcionan información sobre el estado de salud del individuo. El trabajo desarrollado a lo largo de esta Tesis Doctoral se ha estructurado en tres capítulos en los que se describen los tres métodos analíticos desarrollados y que ponen de manifiesto los buenos resultados que proporciona la combinación de las técnicas de microextracción con LC-HRMS. Así, en el Capítulo I se ha propuesto la determinación de capsaicinoides mediante microextracción dispersiva líquido-líquido (DLLME) en orina humana procedente de pacientes tratados con cremas analgésicas a base de capsaicina. Los resultados del análisis de las muestras se estudiaron mediante enfoque no dirigido, ampliándose la búsqueda a la detección de posibles metabolitos derivados de los capsaicinoides objeto de estudio y a especies conjugadas formadas por unión de los analitos a biomoléculas. En el Capítulo II, y siguiendo con la familia de los capsaicinoides, se ha propuesto un nuevo método analítico para su determinación en suero humano aplicando la técnica de microextracción dispersiva en fase sólida magnética (DMSPE) y LC-HRMS. En este capítulo también se presenta el análisis no dirigido de las muestras y, además, y gracias a los datos proporcionados por los espectros de masas se han podido dilucidar los patrones de fragmentación de los analitos y proponer una estrategia para la identificación de posibles metabolitos derivados de la metabolización. Por último, en el Capítulo III, se propone un método para la determinación de aminas biogénicas en orina humana haciendo uso de la técnica DLLME y LC-HRMS. De forma previa a la microextracción de los analitos se incluye una etapa de derivatización que mejora la sensibilidad y la selectividad del método propuesto. También en este capítulo, se ha planteado un estudio no dirigido de las muestras orientado a la búsqueda de compuestos relacionados con las aminas biogénicas, así como posibles metabolitos y conjugados con otras biomoléculas, cuya vía de excreción más probable es la orina