Activación de la MAPK de Saccharomyces cerevisiae SLT2 : mecanismo molecular e implicación en el fenotipo de multigemación de células carentes de la fosfatasa PTC1

Abstract

La proteín quinasa activada por mitógenos (MAPK) de la ruta de integridad celular (CWI) de Saccharomyces cerevisiae, Slt2, es esencial para la respuesta frente al daño sobre la pared celular. La activación completa de las MAPKs depende de la fosforilación dual en la treonina y tirosina del motivo TXY de su bucle de activación (T190-E-Y192 en Slt2). Sin embargo, en muchos casos, las fosforilaciones individuales en estas posiciones pueden tener funciones diversas, por lo que su estudio resulta muy interesante para entender el mecanismo de activación de las MAPKs. La proteín fosfatasa Ptc1 regula la señalización a través de la ruta CWI, así como distintas funciones celulares, de modo que las células carentes de Ptc1 muestran hiperfosforilación de Slt2 y defectos en la separación celular, entre otras alteraciones. La separación celular está supeditada a la entrada del factor de transcripción Ace2 al núcleo de la célula hija y a la consiguiente expresión de genes como CTS1 y DSE1. La deleción de MKK1, que codifica la principal MAPKK de Slt2, atenúa dichas alteraciones del mutante ptc1. Sin embargo, los mecanismos reguladores subyacentes a estas alteraciones son desconocidos. Con estos antecedentes, en esta tesis doctoral se establecieron dos objetivos: (i) caracterizar la dinámica de fosforilación y desfosforilación de la T190 y de la Y192 de Slt2 y la importancia que tienen estas fosforilaciones, así como otros residuos y dominios propuestos como relevantes en otras MAPKs, sobre la funcionalidad de Slt2 y (ii) caracterizar el fenotipo de multigemación de las células ptc1 sometidas a estrés térmico y la contribución de la ruta CWI a las alteraciones de este mutante. El uso combinado de anticuerpos específicos para los sitios fosforilados del motivo TEY y el análisis de afinidad por fosfato (Phos-tag), reveló la existencia de cuatro estados de fosforilación de Slt2 (monofosforilada en T190 o en Y192, doblemente fosforilada y no fosforilada), siendo la forma no fosforilada mucho más abundante, incluso en condiciones de estimulación de la ruta CWI. De las formas monofosforiladas, sólo la T190 mostró una actividad biológica y catalítica parcial, mientras que la Y192 resultó fundamental para la subsiguiente fosforilación y desfosforilación de la T190 por parte de las MAPKKs activadoras Mkk1/2 y de la fosfatasa Msg5. Esto indica que la activación de Slt2 es un proceso ordenado en el que la Y192 actúa como punto inicial de la regulación. También se demostró que el residuo conservado T195 es crítico para la funcionalidad de Slt2 y que su eliminación supone un incremento en la fosforilación de la Y192, como ocurre con otras versiones mutantes de Slt2 con una actividad reducida. La coexistencia de diferentes formas fosforiladas de Slt2 con distinta función biológica pone de manifiesto la importancia de determinar con precisión el estado de fosforilación de Slt2 en diferentes condiciones de estimulación. Los mutantes ptc1 bajo estrés térmico mostraron defectos en la separación celular y en la señalización a través de la ruta TORC1-Sch9, así como hiperpolarización mitocondrial y acumulación de ROS. Estas alteraciones se redujeron de manera significativa al inhibir la actividad quinasa de Slt2. En las yemas de las células multigemadas ptc1, paradas en la fase G1 del ciclo celular, las septinas se relocalizaron en la región cortical formando estructuras que, al colocalizar parcialmente con la proteína autofágica Atg9, podrían estar relacionadas con la biogénesis de los autofagosomas y con el incremento en la actividad autofágica observada. Asimismo, Ace2 se translocó al núcleo de las hijas. Sin embargo, a diferencia de Dse1, la endoquitinasa Cts1 no se encontró en el septo. Tomados en su conjunto, estos resultados indican la importancia de la actividad quinasa de Slt2 y de la fosfatasa Ptc1 en la regulación de procesos esenciales en S. cerevisiae, tales como la separación celular, la autofagia o el ciclo celular.