Regulación de las proteínas quinasas c por fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato

Resumen

En esta Tesis Doctoral, de mención europea, se ha caracterizado el mecanismo molecular por el que la PKC alpha se activa en diferentes tipos celulares. Trabajos bioquímicos previos realizados en nuestro laboratorio mostraron que la región polibásica del dominio C2 de la PKC alpha parecía desempeñar un papel clave en el mecanismo de localización de dicha proteína en vesículas modelo en presencia de PtdIns(4,5)P2. Por ello, el principal interés al inicio de esta tesis fue el de caracterizar el papel de esta región polibásica en el mecanismo de localización de la PKC alpha "in vivo", en células intactas. Para ello, en primer lugar se caracterizó el mecanismo molecular de este isoenzima en células PC12 diferenciadas con NGF. Se sabe que estas células son un buen modelo de células nerviosas ya que responden a la estimulación con NGF diferenciándose a neuronas, y también responden al neurotransmisor ATP. En nuestros estudios demostramos que la estimulación de dichas células con ATP extracelular, activa a los receptores P2X de la membrana plasmática y permite la entrada de un pulso de calcio desde el exterior al interior de la célula. Este calcio es el motor que dirige la traslocación de la PKC alpha a la membrana plasmática. Hemos demostrado, mediante el uso de mutantes de la PKC alpha, de inhibidores de la fosfolipasa C y de sondas de DAG y PtdIns(4,5)P2, que en la membrana, la PKC se ancla por diversos residuos de su región polibásica, probablemente por su interacción con PtdIns(4,5)P2. Estos resultados se corroboraron no sólo en este sistema celular sino también en las células RBL-2H3, donde la fosfolipasa C tiene una mayor actividad y genera mayores cantidades de DAG, y así el PtdIns(4,5)P2 está reducido. Mediante el uso de mutantes en la región polibásica, se demostró que esta región también en este tipo celular es esencial en el mecanismo de localización de la PKC alpha en la membrana y que la región de unión a calcio no