El silenciamiento génico de Mucor circinelloides regula la cromatina centromérica y la virulencia

Resumen

Desde su descubrimiento en la década de los 90, el silenciamiento génico ha revolucionado el campo de la genética y la biología molecular, donde continúa inspirando investigaciones innovadoras por toda la comunidad científica. Las moléculas de RNA de doble cadena disparan el mecanismo de RNAi, que reconoce los RNAs mensajeros complementarios y dirige su degradación, o bloquea su traducción a proteínas. Un mecanismo de defensa contra ácidos nucleicos invasivos - exógenos o endógenos - en su origen, ha evolucionado a un fenómeno de regulación complejo que no solo protege al genoma, sino que también controla la expresión génica. Para llevar a cabo su función, el mecanismo de RNAi necesita moléculas de RNAs pequeños (sRNAs) que guían a los complejos catalíticos hacia sus dianas por complementariedad de bases. Este mecanismo está conservado en los linajes principales de eucariotas, aunque existen diversas rutas de biogénesis que generan distintos tipos de sRNAs. El reino Fungi es un ejemplo de esta diversidad, ya que encierra numerosas rutas de RNAi implicadas en regular sus ciclos de vida. Este trabajo propone al hongo basal Mucor circinelloides como modelo para estudiar el papel del RNAi en controlar procesos biológicos esenciales para la función cromosómica y la patogénesis. M. circinelloides presenta rutas de RNAi canónicas y no canónicas que interaccionan entre sí para regular la expresión, estabilidad y transmisión de su genoma. Este ubicuo habitante del suelo presenta un estilo de vida saprofítico, pero puede convertirse en un patógeno oportunista de animales causando una infección frecuentemente letal conocida como mucormicosis. En este trabajo se han identificado homólogos conservados del cinetocoro, un puente proteico que une los centrómeros a los microtúbulos durante la división celular. Sorprendentemente, M. circinelloides y todos los Mucorales carecen de la variante centromérica de histonas H3 CENP-A, esencial para unirse a la cromatina centromérica, pero han retenido la mayoría de las proteínas del cinetocoro. Un análisis funcional y ensayo de ChIP-seq contra proteínas conservadas del cinetocoro reveló nueve centrómeros, a los que se anclan los cinetocoros de manera monocéntrica durante todo el proceso de división celular. Los centrómeros en mosaico de M. circinelloides presentan características de centrómeros puntuales definidos genéticamente, como su tamaño pequeño y un motivo de DNA altamente conservado; pero también exhiben rasgos distintivos de centrómeros regionales, principalmente sus enormes regiones pericéntricas colonizadas por retrotransposones. Este retrotransposon es similar a los LINE1 humanos, y está conservado en todas las especies del subfilo Mucoromycotina que carecen de CENP-A. Se denominó Grem-LINE1, y se propone que participa en determinar la identidad centromérica en ausencia de CENP-A. Los Grem-LINE1 están silenciados activamente mediante sRNAs canónicos, lo que indica que el RNAi está implicado en mantener la estabilidad genómica y determinar la identidad centromérica. Además, se ha detectado un aumento de sRNAs canónicos antisentido a los Grem-LINE1 en mutantes que carecen de la ruta de RNAi no canónica (NCRIP), lo que apoya las observaciones previas que apuntaban a una interacción antagonista entre la ruta no canónica sobre la canónica en M. circinelloides. Esta regulación coordinada mediante RNAi juega un papel esencial en la interacción con el sistema inmune innato del hospedador. Al comparar dos patotipos con opuesto potencial virulento, se descubrió una respuesta genética implicada en la supervivencia y germinación durante la fagocitosis por macrófagos. El ambiente hostil del fagosoma dispara esta respuesta, induciendo dos factores de transcripción activadores, Atf1 y Atf2, y remodela una enorme red génica que incluye genes que cifran la aquaporina Aqp1, y dos posibles efectores de secreción o de membrana, Chi1 y Pps1. Estos genes también se inducen in vivo en macrófagos peritoneales de ratón, siendo necesarios para la virulencia en un modelo de infección murino. NCRIP ejerce un control preciso sobre esta respuesta, reprimiéndola durante condiciones no estresantes y liberándola ante un estímulo estresante, como los que la espora encuentra al ser fagocitada. Estos resultados sugieren que la actividad de NCRIP se reprime durante la fagocitosis, correlacionando con un aumento en la expresión de los genes de la ruta canónica de RNAi. Este aumento en la expresión de la ruta canónica de RNAi también se ha observado en los mutantes que carecen de actividad NCRIP. Como consecuencia, los mutantes NCRIP son incapaces de reprimir la respuesta a la fagocitosis y desarrollan una adaptación preexposición a las condiciones estresantes que los protegen frente al daño oxidativo. Esto se manifiesta a nivel transcripcional, ya que el perfil transcriptómico de los mutantes NCRIP en condiciones no estresantes imita al de una estirpe silvestre siendo fagocitada. Sorprendentemente, los mutantes NCRIP son menos virulentos que la estirpe silvestre, sugiriendo que la desregulación de la respuesta a la fagocitosis, ocasionada por la ausencia de actividad NCRIP, afecta a los procesos necesarios para la virulencia. Como conclusión, estos resultados ofrecen un análisis detallado de dos rutas de RNAi que interaccionan en M. circinelloides para regular funciones biológicas esenciales, y arrojan luz sobre su potencial virulento, lo que podría contribuir al desarrollo de terapias contra la mucormicosis.