Advances in canine leishmaniosis with emphasis on the use of saliva samples

Resumen

Esta tesis como compendio de publicaciones fue concebida para profundizar en el estudio del desarrollo de ensayos que permitieran el uso de muestras de saliva para diagnosticar leishmaniosis en perros. Los objetivos fueron: (1) desarrollar y validar un ensayo ultrasensible para la cuantificación de anticuerpos anti-Leishmania que permitiera su medición en suero y saliva de perro; (2) evaluar la utilidad del nuevo ensayo con muestras de suero y saliva para monitorizar el tratamiento frente a leishmaniosis canina (LCan); (3) evaluar la relación entre los niveles de anticuerpos anti-Leishmania en suero de perro medidos con el nuevo ensayo y por un ELISA comercial y la concentración de proteínas de fase aguda; (4) evaluar, mediante el nuevo ensayo, la cinética de los niveles de IgG2 e IgA anti-Leishmania en suero y saliva de perros infectados experimentalmente con L. infantum durante un año de seguimiento; (5) estudiar el posible ritmo circadiano en los niveles de IgG2 e IgA anti-Leishmania en suero y saliva de perros infectados experimentalmente; (6) y desarrollar y validar una PCR a tiempo real para la cuantificación de ADN de Leishmania spp. en saliva canina. La precisión, la exactitud y la sensibilidad analítica de cada ensayo fueron evaluadas mediante los coeficientes de variación intra- e inter-ensayo, la linealidad bajo dilución, el porcentaje de recuperación y el estudio de correlación, y los límites de detección y cuantificación. Para ello, se recogieron muestras de suero y saliva de perros seronegativos y seropositivos a Leishmania spp. Para evaluar la utilidad de los TR-IFMAs en suero en la monitorización del tratamiento se obtuvieron muestras de suero de 16 perros seropositivos a Leishmania spp. en el momento del diagnóstico y tras 30 y 180 días de tratamiento. Del mismo modo, para evaluar la utilidad de los TR-IFMAs en la monitorización del tratamiento con muestras de saliva, se recogieron muestras de suero y saliva de 20 perros con signos clínicos compatibles con LCan en el momento del diagnóstico y después de 30 días de tratamiento. También se usaron 205 muestras de suero para evaluar la correlación entre TR-IFMA y un ELISA comercial y la concentración de proteínas de fase aguda en el momento del diagnóstico de LCan y durante la monitorización del tratamiento. Para estudiar la cinética de los niveles de anticuerpos anti-Leishmania se tomaron mensualmente durante 1 año muestras de suero y saliva de 11 perros infectados experimentalmente con Leishmania infantum y se analizaron por TR-IFMA. Para evaluar el posible ritmo circadiano en los niveles de anticuerpos anti-Leishmania, muestras de suero y saliva de 6 perros infectados experimentalmente que presentaban signos clínicos compatibles con LCan se recogieron a intervalos de 4 horas durante un periodo de 16 horas en dos días consecutivos. Finalmente, para el desarrollo y validación de una PCR a tiempo real para la detección de ADN de Leishmania spp. en saliva de perro se recogieron salivas de 16 perros infectados experimentalmente pre-infección y 16 semanas post-infección. Las conclusiones de esta tesis doctoral son: 1. Los ensayos inmunofluorométricos desarrollados en esta tesis doctoral permiten la cuantificación de anticuerpos IgG2 e IgA anti-Leishmania en suero y saliva de perro, siendo los niveles más elevados en perros seropositivos. Se observó solapamiento en los niveles de IgA anti-Leishmania entre seropositivos y seronegativos. 2. Los ensayos desarrollados detectan disminuciones en los niveles de IgG2 e IgA anti-Leishmania en suero y saliva de perros después del tratamiento, asociado con mejoría clínica. 3. El ensayo desarrollado para detectar IgG2 anti-Leishmania mostró mayor correlación con los resultados de CRP y ferritina en perros tratados que el ELISA. 4. Los niveles de IgG2 e IgA anti-Leishmania en suero y saliva de perros aumentan por encima del punto de corte del ensayo TR-IFMA tras la infección experimental. Además, el TR-IFMA desarrollado para la detección de IgG2 anti-Leishmania ofrece mejor valor diagnóstico que el desarrollado para IgA anti-Leishmania. 5. No se ha observado ritmo circadiano en los niveles de IgG2 e IgA anti-Leishmania tanto en suero como en saliva de perros con LCan en un periodo de 16 horas en dos días consecutivos. Además, se han observado mayores variaciones en los niveles de estos anticuerpos en saliva que en suero. 6. La PCR a tiempo real desarrollada permite la cuantificación de ADN del cinetoplasto de Leishmania spp. en saliva de perros infectados experimentalmente con L. infantum. No obstante, hay que tener en cuenta que la sensibilidad del ensayo en saliva es menor que en médula ósea.