Estudio cinético sobre la especificidad de sustrato y el mecanismo de reacción en las actividades monofenolosa y difenolasa de tirosinasa de champiñón

Resumen

Se ha realizado el estudio cinético de la actividad difenolasa de tirosinasa, utilizando diversas técnicas conceptuales y experimentales. Se han elaborado análisis cinético en estado estacionario y pre-estacionario sobre el mecanismo de reacción de la actividad difenolasa de tirosinasa, además se han efectuado ensayos cinéticos simulados, mediante integración numérica de los correspondientes sistemas de ecuaciones diferenciales. Se han realizado ensayos de RMN, así como ensayos cinéticos experimentales oximétricos y espectrofotométricos, sin y con flujo detenido, utilizando en éste caso un nuevo método con ácido ascórbico que permite la detección espectrofotométrica de oxitirosinasa. Se han determinado los valores de diversas constantes cinéticas, así como calculado los valores de distintas constantes de velocidad, del mecanismo de reacción de tirosinasa sobre orto-difenoles. Todas estas constantes cinéticas están reguladas por efectos electrónicos, estéricos e hidrofóbicos, originados por la cadena lateral sustituyente en C1 de los sustratos orto-difenólicos de tirosinasa. Para el estudio cinético de la actividad monofenolasa de tirosinasa, se han utilizado las técnicas conceptuales y experimentales anteriormente descritas para la actividad difenolasa, junto con las siguientes técnicas adicionales. Se ha realizado un análisis cinético electroquímico, así como ensayos experimentales de voltametría cíclica y cronoamperometría. Se han realizado ensayos de volatilización mediante sililación de sustratos, intermedios y productos de reacción, para su posterior separación mediante cromatografía de gases y detección con espectometría de masas (GC-MS). Se ha determinado los valores de las constantes cinéticas para diversos para- y meta-monofenoles, así como los valores de sus respectivos desplazamientos químicos en C3 y C4. Se ha determinado que las etapas de ataque nucleofílico y electrofílico so