Purificación de enzimas nadh-dependientes de pediococcus acidilactici mediante colorantes textiles y ciclodextrinas

Resumen

La bacteria del ácido láctico Pediococcus acidilactici crecida aeróbicamente en un medio conteniendo glicerol como carbohidrato fermetable resultó ser una buena de enzimas NADH-dependientes, permitiendo la obtención de las enzimas modelo en el estudio de las interacciones entre proteínas y colorantes reactivos, lactato deshidrogenasa y NADH-oxidasa. La combinación de dos columnas de afinidad en tandem y de distintas estrategias de elución inespecíficas, con etilenglicol, y específicas, con NADH, permite desarrollar un método de purificación en un solo paso para el caso de la L-LDH, obteniendo una enzima purificada en 58 veces con un 85% de recuperación, en dos pasos para el caso de la NADH-peroxidasa, con una purificación de 146 veces y un 59% de recuperación, y en tres pasos para el caso de la NADH-oxidasa (NOX-2), con una purificación de 18 veces y un 41% de recuperación. La NADH-peroxidasa de Pediococcus acidilactici puede obtenerse pura combinando la cromatografía de afinidad en tandem con una columna de intercambio aniónico, obteniendo un grado de purificación tres veces superior al citado en la bibliografía para la NADH-peroxidasa de Enterococcus faecalis, manteniéndose su porcentaje de recuperación. Así mismo, se reduce el tiempo de purificación a un tercio, de tres días a un solo día. La L-LDH de Pediococcus acidilactici, purificada sobre una columna de Procion Red MX-5B, presenta una gran especificidad por sus sustratos naturales, piruvato, L-lactato, NADH y NAD+, obteniéndose para todos ellos curvas de saturación Michaelianas, confirmándose la naturaleza no alostérica de esta enzima. Los parámetros cinéticos calculados sugieren fuertemente que el papel principal de esta L-LDH in vivo es la reducción de piruvato con la consiguiente reoxidación de NADH. Esta deshidrogenasa es fuertemente inhibida por numerosos colorantes textiles compitiendo éstos con el NADH. Durante esta tesis se ha desarr