Análisis de expresión génica múltiple aplicado al estudio de los mecanismos antiproliferativos sobre células de cáncer de colon de un alimento rico en compuestos fenólicos

Resumen

En los últimos años se ha acumulado una gran cantidad de evidencias epidemiológicas y experimentales que indican que los compuestos fenólicos ingeridos con los alimentos de origen vegetal pueden, en parte, estar implicados en la posible prevención y/o retardo de la aparición de ciertas formas de cáncer. Las propiedades anticancerígenas y antiproliferativas de muchos de estos compuestos han sido estudiadas en modelos representativos de diversos tipos de cáncer tanto in vitro como in vivo. Entre estos estudios y desde un punto de vista nutricional, la investigación sobre la prevención o reducción de cánceres del tracto digestivo reviste un especial interés, puesto que es en el lumen gastrointestinal donde pueden acumularse de forma importante estos compuestos y/o sus derivados fisiológicos. A pesar de la gran cantidad de evidencias acumuladas, existe todavía un gran desconocimiento de los mecanismos moleculares por los cuales los compuestos fenólicos de la dieta ejercen posibles efectos beneficiosos frente al desarrollo de cáncer. En la presente Tesis Doctoral, se ha investigado la actividad antiproliferativa de un producto alimentario caracterizado por una composición rica y variada en compuestos fenólicos. El objetivo principal era ahondar en el estudio de los posibles mecanismos moleculares por los que el efecto antiproliferativo tiene lugar. Para ello, se ha utilizado un modelo celular in vitro de cáncer de colon humano representativo de uno de los tipos de cáncer del tracto digestivo de mayor incidencia en la actualidad. A diferencia de trabajos anteriores, en esta tesis hemos considerado de interés y abordado los siguientes aspectos: i) estudiar los efectos antiproliferativos de un alimento rico en compuestos fenólicos y no de los compuestos individuales, puesto que es la mezcla de todos los compuestos la que, in vivo, debe llegar y acumularse en el tracto digestivo; ii) determinar los efectos que la digestión gastroduodenal puede ejercer sobre los compuestos fenólicos y consecuentemente si dichos compuestos pueden llegar o no como tales al resto del intestino; iii) estudiar el efecto antiproliferativo del alimento digerido sobre las células cancerosas de colon bajo condiciones experimentales adecuadas que simulen en lo posible la situación in vivo (dosis y tiempos representativos de la situación fisiológica); iv) investigar los mecanismos moleculares de respuesta celular mediante técnicas de análisis de expresión génica múltiple para lo cual hemos desarrollado y aplicado técnicas de micro- y macroarrays, que nos permiten estudiar simultáneamente de cientos a miles de genes. En la primera parte del trabajo se procedió a seleccionar un producto alimentario rico en compuestos fenólicos, que nos sirviera como producto modelo para el estudio. Para ello, obtuvimos y caracterizamos una serie de concentrados comerciales de frutos rojos de origen industrial, utilizados normalmente en la fabricación de zumos y de interés por su posible aplicación en la elaboración de nuevos alimentos funcionales. Todos los concentrados estudiados constituyen una fuente importante de compuestos fenólicos, principalmente antocianos, procianidinas, flavonoles y derivados de hidroxicinámicos. Mediante ensayos in vitro, también se determinó la capacidad antioxidante de estos concentrados ya que los compuestos fenólicos mencionados ejercen una importante actividad antirradical que, en parte, ha sido asociada a la protección frente a la aparición de enfermedades degenerativas como el cáncer. De entre los productos analizados, el concentrado de zumo de aronia presenta una mayor concentración de compuestos fenólicos, además de una alta capacidad antioxidante. Desde el punto de vista de la industria alimentaria, este concentrado podría ser interesante como ingrediente para la fabricación de zumos funcionales, es decir, zumos que, consumidos como parte de la dieta normal del individuo, ofrezcan beneficios para la salud y reduzcan el riesgo de sufrir enfermedades. Sin embargo, para llegar a obtener productos comerciales adecuados no podemos basarnos sólo en su composición inicial en compuestos bioactivos, o en las propiedades antioxidantes in vitro, sino que es indispensable ahondar en la investigación de las propiedades beneficiosas específicas de estos productos y demostrar sus funciones in vivo. Una buena parte de los estudios científicos sobre los efectos beneficiosos de los compuestos fenólicos, han investigado estos compuestos de forma individual, aislados del resto de un alimento complejo, y, por lo general, a concentraciones muy altas que permiten observar o medir claramente los efectos (dosis efectivas, aunque no nutricionales). Estas condiciones, sin embargo, no se corresponden con las que se producirían en el organismo en condiciones fisiológicas normales a partir de la ingesta con la dieta (dosis nutricionales más bajas y repetitivas). Además, en el organismo vivo habría que tener en cuenta otros aspectos tales como el proceso de la digestión gastrointestinal, que puede producir alteraciones importantes en la estructura molecular de los compuestos ingeridos y modificar decisivamente sus propiedades iniciales. Se ha demostrado que los compuestos fenólicos de la dieta presentan una baja biodisponibilidad y, por tanto, es previsible que tras el consumo regular de alimentos ricos en compuestos fenólicos, en el tracto intestinal y en particular en el colon, se podría acumular una cantidad relevante de una mezcla compleja de compuestos fenólicos y sus derivados formados durante la digestión. En esta línea, en la segunda parte de esta Tesis Doctoral nos propusimos determinar mediante pruebas in vitro los efectos de la digestión gastrointestinal sobre la composición y estabilidad de los compuestos fenólicos presentes en el zumo de aronia. Los resultados obtenidos indican que estos compuestos fenólicos son bastante estables en las condiciones ácidas de la digestión gástrica pero que, una vez pasan al duodeno, donde las condiciones químicas son alcalinas, comienzan a sufrir alteraciones importantes de degradación o de transformación. Aunque en este trabajo no hemos identificado exactamente los compuestos formados, es de suponer que es la mezcla de compuestos iniciales junto con estos derivados la que, en principio, avanzaría hacia el colon y allí podría ejercer efectos múltiples sobre la mucosa epitelial. En la siguiente parte de esta Tesis Doctoral se realizó el estudio de los efectos del zumo de aronia digerido sobre el modelo celular de cáncer de colon humano (células Caco-2). El ensayo se diseñó de manera que las células fueran expuestas a cantidades del digerido de zumo equivalentes a cantidades totales de compuestos fenólicos representativas de las que podrían encontrarse en el colon tras la ingesta del zumo de aronia como parte de la dieta. Además, para simular un consumo regular de este producto, se eligió tratar a las células de forma reiterada durante 4 días. También se consideró importante reducir los períodos de tratamiento a 2 horas para que no se degradaran los compuestos fenólicos en el medio de cultivo. En paralelo, se tuvo también en cuenta que las dosis aplicadas a las células no produjeran efectos tóxicos letales por modificación extrema en el pH y la osmolalidad del medio de cultivo, circunstancias que enmascararían un efecto anti-proliferatvio real. Los resultados de los tratamientos indicaron que el zumo de aronia digerido induce una importante inhibición de la proliferación y un bloqueo del ciclo celular en la fase G2/M en las células de cáncer de colon a las dosis y tiempos estudiados. El siguiente paso fue entonces intentar establecer los posibles mecanismos moleculares por los cuales el tratamiento aplicado inducía esta respuesta en las células de cáncer de colon. Para ello se aplicaron técnicas de análisis de expresión génica múltiple (micro- y macroarrays), que nos permiten medir las diferencias en los niveles de expresión de miles o cientos de genes entre las células tratadas y las células no tratadas. A partir de estos grupos de genes diferenciados, intentamos seleccionar algunos genes de interés en relación con el proceso antiproliferativo observado y establecer algunos de los mecanismos moleculares puestos en marcha en las células como respuesta al tratamiento. Nuestros resultados evidenciaron una serie de cambios en los niveles de expresión de grupos de genes involucrados en varios procesos biológicos tales como: transducción de señales, proliferación celular, transcripción, apoptosis, adhesión celular y metabolismo. Entre los genes modificados por el tratamiento, detectamos la sobre-expresión de CEACAM1 tanto a nivel génico como proteico. Se trata de un gen supresor de tumores, que juega un importante papel regulador en la proliferación celular y cuya expresión está reducida en más de un 85% de los adenomas y carcinomas colorrectales en las etapas iniciales de desarrollo. Este gen podría constituir un gen marcador de interés en relación con los efectos antiproliferativos ejercidos por los compuestos fenólicos. Si los niveles de CEACAM1 están reducidos en una alta proporción de lesiones hiperplásicas, previas a las lesiones neoplásicas, la regulación e inducción de esta proteína en células pre-malignas podría estar asociada a efectos reductores de proliferación y, por tanto, protectores frente al progreso de la malignidad. Nuestros estudios también detectaron otros genes que responden al tratamiento y que podrían estar implicados en los mecanismos moleculares subyacentes a la inhibición de la proliferación y el bloqueo del ciclo celular observado en las células tratadas. Es el caso de varios genes que codifican diversas kinasas y fosfatasas, involucradas en rutas de señalización mitogénicas, que culminan con la regulación de la proliferación y del ciclo celular y que son esenciales para el mantenimiento de la homeostasis celular y para evitar la aparición y el desarrollo del cáncer. Entre estos genes destacan las fosfatasas DUSP6, DUSP1, PTPN11 y PTPN12 y el mediador de señalización SRC. Otros genes, también modulados por el tratamiento, están directamente implicados en la regulación y control de las distintas fases del ciclo celular e incluyen: el supresor tumoral TP53, CDKN1A (p21), SFN (14-3-3?), GADD45, RAD51, BIRC5, las ciclinas CCNF y CCND2, y la Ubiquitina C. En esta tesis se incluye un diagrama que recoge el flujo de unión de todas estas proteínas y que constituye la hipótesis molecular de, al menos, uno de los mecanismos puestos en marcha en las células estudiadas en respuesta al tratamiento con el zumo de aronia. Los resultados presentados en esta tesis contribuyen a la investigación sobre los posibles mecanismos moleculares antiproliferativos, atribuidos a los alimentos ricos en compuestos fenólicos, sobre un modelo de cáncer de colon. Nuestros resultados sugieren que el consumo de ciertos alimentos ricos en compuestos fenólicos podría ejercer, a nivel del epitelio colónico, efectos moduladores sobre los niveles de grupos de genes y proteínas implicados en señalización mitogénica y control de la proliferación y ciclo celular. Esta regulación se podría traducir en el control del estado proliferativo de las células epiteliales que, a su vez, evitaría la propagación de lesiones pre-malignas tempranas que desembocarían en la aparición de cáncer. Durante el desarrollo de esta tesis se han puesto a punto y aplicado técnicas de análisis de expresión génica múltiple: micro- y macroarrays. Los arrays de cDNA son herramientas novedosas y útiles para el análisis de los cambios a nivel molecular ocasionados por un estímulo externo y que pueden proporcionar mucha información sobre los mecanismos celulares puestos en marcha. No obstante, hay que tener presente que esta metodología es relativamente reciente y aún presenta ciertas dificultades de análisis e interpretación dada la enormidad y complejidad de los resultados que se obtienen. Como hemos podido observar en nuestros estudios, sobre todo en los realizados con los macroarrays, estas técnicas presentan una gran variabilidad inter- e intra- muestral. Para conseguir resultados reproducibles, es necesario desarrollar un diseño experimental robusto que, en general, implica incrementar el número de réplicas tanto biológicas como tecnológicas (en este caso depende del tipo de array) y realizar un estudio estadístico apropiado. Todo esto conlleva el encarecimiento de los ensayos. En lo que se refiere al análisis de los datos, hay que establecer una serie de criterios para analizar los resultados. El denominado valor cut-off, que marca la diferencia entre lo que se considera cambio y no cambio de expresión, es un valor que puede ser más o menos arbitrario y ciertamente subjetivo, del cual dependerá la selección final de genes que son aceptados como diferenciados entre las dos condiciones comparadas (por ejemplo, tratado vs. control, enfermo vs. sano, etc). Una vez que se obtienen los resultados, es importante y útil llevar a cabo estudios de interpretación biológica que suele hacerse con la ayuda de herramientas bioinformáticas. Esta parte también puede verse afectada por la herramienta empleda o, incluso, por el sesgo personal del investigador. Todos estos aspectos tendrán un gran efecto sobre los resultados de los análisis con microarrays. En general, los resultados de microarrays necesitan muchos ensayos posteriores de confirmación con otras técnicas moleculares, como las técnicas de RT-PCR a tiempo real. Además, los cambios en los niveles de ARNm no siempre se correlacionan con cambios paralelos en las proteínas y/o metabolitos. Para comprender la relevancia biológica de los cambios detectados a nivel génico, los estudios deberán complementarse mediante la confirmación a nivel proteico, e incluso metabólico, de los cambios observados. La continuación del estudio presentado en esta tesis implica pues la validación del mecanismo propuesto mediante ensayos que confirmen los cambios a nivel de proteína. Una vez confirmado el mecanismo, proponemos que sería de gran interés investigar si éste se verifica en otros modelos celulares de cáncer de colon, así como determinar la respuesta de modelos celulares de colon no cancerosos frente al tratamiento con el zumo de aronia, para establecer así la especificidad de la respuesta celular. A medio-largo plazo, los avances en el conocimiento del genoma humano y su biología, junto con la reducción en los costes de esta tecnología, harán de las técnicas de análisis de expresión génica múltiple unas herramientas muy prometedoras para el estudio de aquellos mecanismos moleculares responsables del inicio y desarrollo de enfermedades tan importantes para nuestra sociedad como el cáncer y otras enfermedades degenerativas.