Inhibición de la dihidrofolato reductasa por las catequinas del téefectos celulares y moleculares del bloqueo del ciclo del ácido fólico

Resum

En la presente Tesis Doctoral se ha llevado a cabo el estudio de la inhibición de la dihidrofolato reductasa (DHFR) por las catequinas del té verde. Para ello se estudió la relación estructura-función en los inhibidores de la DHFR llegando a la conclusión de que las catequinas galoiladas, epigalocatequín galato (EGCG) y epicatequín galato, son análogos estructurales de los mismos, y, por lo tanto, de su sustrato, el dihidrofolato. Los modelajes in silico de la interacción entre el EGCG y la enzima mostraron que era factible su unión en el mismo sitio que el DHF. In vitro se estudió la unión de dichas catequinas a la DHFR y la inhibición de su actividad por las mismas. Para ello se empleó le enzima de distintas fuentes biológicas (humana, bovina, de pollo y de Lactobacillus casei) y técnicas de espectroscopía de absorción, fluorimetría, calorimetría isotérmica diferencial y resonancia magnética nuclear. Los resultados indicaron que tan sólo las catequinas galoiladas se unen a la DHFR favorecidas por una variación de entalpía negativa, con una estequiometría de uno, constantes de disociación menores o iguales que la unidad de micromolar y cooperatividad negativa con el cofactor. Los estudios de actividad permitieron elucidar los mecanismos cinéticos de inhibición, así como obtener las constantes cinéticas que los caracterizan. La enzima de pollo presentó una inhibición reversible competitiva respecto al DHF caracterizada por una constante de inhibición de aproximadamente 10 M, mientras que las enzimas humana y bovina experimentaron una inhibición dependiente del tiempo caracterizada por unas constantes de inhibición del orden de nanomolar y la formación de un complejo ternario de lenta disociación con el cofactor o el sustrato. Por último, se investigó in vivo la inhibición de la DHFR por el EGCG usando diferentes líneas celulares tumorales de mamífero. En concreto, en una línea de linfoma de ratón y otra humana se observó la inhibición del crecimiento debida a la inhibición de la síntesis de nucleótidos de purinas y pirimidinas y ROS. Esta inhibición se vio disminuida en por la alcalinización del espacio extracelular y la acidificación del citosol que produjo el tratamiento con CsCl, lo que se explica mediante la existencia de un pK ligeramente básico en el EGCG que lo hace quedar atrapado en el exterior celular donde el pH es mayor, así como por la disminución de la afinidad de la DHFR por el EGCG al aumentar el pH intracelular. Finalmente, se estudió el efecto del EGCG sobre una línea de adenocarcinoma humano de colon en la que se observó una inhibición del crecimiento celular y apoptosis caracterizada por la parada del ciclo celular en las fases G1-S, la inhibición de la síntesis de nucleótidos de purinas y pirimidinas, la hipometilación del promotor del gen p16 y por ello expresión de la proteína p16, así como el incremento de la concentración de adenosina extracelular. Pudimos comprobar que dicho incremento se debió a la actuación de la 5'-nucleotidasa, y que éste produjo el incremento de la activación constitutiva del NF- tras un día de tratamiento, pero su inhibición después de tres días mediante la unión de la adenosina a sus receptores específicos. Este incremento de adenosina también resultó ser responsable de la inhibición de la activación del NF- desencadenada por el TNF- mediante la unión de la misma a sus receptores A2a inhibiendo la fosforilación de la Akt, así como de la diferenciación enterocítica de las células mediante un mecanismo opuesto al de sus receptores A3. Todos los efectos celulares observados pueden ser explicados mediante el bloqueo del ciclo del ácido fólico que produce la inhibición de la DHFR, lo que permite explicar la gran mayoría de las propiedades descritas para esta catequina y que coinciden con los asociadas a los inhibidores de la DHFR empleados a nivel clínico (como el metotrexato), especialmente el anticancerígeno y antiinflamatorio.