Cpc2 regula la respuesta a estrés y el ciclo celular en schizosaccharomyces pombe

Resumo

Antecedentes: RACK1 (Receptor for Activated C-Kinase-1) es una proteína de 36 kDa identificada por su capacidad para unirse a PKC activada y miembro de la familia de proteínas con dominios WD40. Este grupo de proteínas están involucradas en la regulación de numerosas funciones biológicas como la transducción de señales, el control del ciclo celular, la organización de la cromatina y la muerte celular programada. Concretamente, la actividad de RACK1 ha sido relacionada con la función y envejecimiento neuronal, el desarrollo embrionario, la adhesión celular, la regulación de las rutas de señalización mediadas por MAP quinasas, la regulación de la traducción, el ciclo celular, cáncer y apoptosis. Un aspecto importante de RACK1 es que es un componente estructural de la subunidad 40S del ribosoma eucariótico, localizando en una región conservada evolutivamente y próxima al túnel de salida de los ARN mensajeros. Cpc2, el ortólogo de RACK1 en la levadura con fisión Schizosaccharomyces pombe, presenta un grado de identidad del 77% a nivel de su secuencia aminoacídica, y también forma parte de la subunidad pequeña del ribosoma. Igualmente, Cpc2 se asocia in vivo con Pck2, uno de los dos ortólogos a la PKC presentes en la levadura con fisión. Los mutantes carentes del gen cpc2+ manifiestan diversos fenotipos, tales como un retraso en la transición G2/M del ciclo celular que conlleva un incremento en el tamaño en división, la dificultad para bloquear el ciclo celular en la fase G1 durante el ayuno de nitrógeno, distintos defectos en la conjugación y esporulación, y sensibilidad al crecimiento a temperatura elevada. Además, se ha descrito que en ausencia de Cpc2 se reduce de manera selectiva la síntesis de algunas proteínas, sin afectar a la síntesis proteica global. Objetivos: El propósito fundamental de esta Tesis Doctoral ha consistido en dilucidar las funciones celulares de Cpc2, ortólogo a RACK1, en la levadura Schizosaccharomyces pombe. En concreto, los objetivos abordados fueron: i) Análisis de la relación funcional entre Cpc2 y las rutas de transducción de señales mediadas por MAP quinasas durante la respuesta celular frente a condiciones de estrés; ii) Estudio del papel de Cpc2 como regulador de la progresión del ciclo celular e identificación de las dianas que participan en dicha regulación. Resultados: En S. pombe existen tres rutas de MAP quinasas responsables de la transducción de los estímulos externos: i) la ruta de respuesta a estrés o SAPK; ii) la vía de integridad celular; y iii) el módulo de respuesta a feromonas que regula el proceso de conjugación. De acuerdo con los resultados obtenidos, Cpc2 participa en las funciones asociadas a la ruta de integridad celular como la septación, la morfología y el mantenimiento de la integridad de pared, pero de manera independiente de la actividad de Pmk1 (MAP quinasa efectora de esta ruta). Al mismo tiempo, Cpc2 modula el grado de fosforilación/activación de las MAP quinasas Pmk1 (ruta de integridad celular) y Sty1 (ruta SAPK) de modo que, en su ausencia, se incrementa el nivel de fosforilación de ambas quinasas tanto en crecimiento vegatativo como en respuesta a estrés. Este incremento en el nivel de fosforilación de las MAP quinasas se debe a que Cpc2 regula positivamente la traducción de las fosfatasas de tirosina Pyp1 y Pyp2, encargadas de desfosforilar a Pmk1 y Sty1. Como resultado, la falta de Cpc2 reduce específicamente los niveles de proteína de ambas fosfatasas sin que se vean alterados los niveles de los respectivos ARN mensajeros. Cpc2 es también necesario para una correcta adaptación celular frente al estrés. Así, regula positivamente la traducción de Atf1, un factor de transcripción implicado en la respuesta a numerosos tipos de estrés, activando la expresión de los genes implicados en la adaptación a las nuevas condiciones. Concretamente, las células carentes de cpc2+ ven reducida su viabilidad frente al peróxido de hidrógeno debido, en parte, a la incapacidad de sintetizar cantidades suficientes de catalasa citoplasmática (Ctt1). Además, Cpc2 regula la transición G2/M del ciclo celular a por medio de Wee1. Las células carentes de cpc2+ muestran un incremento en los niveles de la proteína quinasa Wee1, que inhibe la entrada en mitosis fosforilando e inhibiendo a la quinasa dependiente de ciclina Cdc2, el regulador clave de la transición G2/M del ciclo celular. Sorprendentemente, Cpc2 regula positivamente la traducción de la quinasa Cdr2, uno de los principales reguladores negativos de la actividad de Wee1. Nuestros resultados sugieren que en ausencia de Cpc2 las células de S. pombe presentan mayores niveles de Wee1 y más activos. Finalmente, hemos demostrado que los residuos conservados de Aspártico-36 y Glutámico-38 en Cpc2 son esenciales para su asociación a la subunidad 40S del ribosoma y su actividad biológica. La sustitución de estos residuos por Arginina y Lisina, respectivamente, impiden su unión al ribosoma, provocando que la proteína localice fundamentalmente en la fracción citosólica. Las células que expresan la versión ¿no-ribosomal¿ de Cpc2 muestran los mismos fenotipos que el mutante nulo; es decir, una respuesta defectiva frente al estrés, reducción de los niveles de las proteínas Pyp1, Pyp2 y Atf1, defectos en el desarrollo sexual y retraso en el ciclo celular. Conclusiones: Los resultados obtenidos en la presente Tesis indican que Cpc2 constituye un elemento clave en la regulación traduccional de la levadura S. pombe afectando a múltiples procesos celulares. Ejerciendo una regulación selectiva de la traducción de los ARN mensajeros, Cpc2 modula la actividad de las rutas de MAP quinasas favoreciendo la síntesis de las fosfatasas Pyp1 y Pyp2; por otra parte, regula la expresión de elementos involucrados en la respuesta a estrés como el factor de transcripción Atf1 y la catalasa citoplasmática Ctt1 implicados en la detoxificación del peróxido de hidrógeno. Además, rmodula los niveles de proteína de Wee1 y Cdr2, regulando así la progresión del ciclo celular. De acuerdo con nuestros datos, es necesaria la unión de Cpc2 al ribosoma para llevar a cabo todas sus funciones biológicas en este organismo modelo.