Clonación y evolución dirigida de enzimas implicadas en la modificación de la cefalosporina y sus derivados

Resumen

Para llevar a cabo la desacetilación de la cefalosporina y sus derivados, la primera Ramnogalacturonan acetil esterasa (YesT) bacteriana, procedente de Bacillus subtilis, fue clonada y caracterizada. YesT fue capaz de actuar sobre sustratos cefalosporánicos y sobre el xilano, presentando un efecto sinérgico cuando actuaba en combinación con -xilanasa. El alineamiento de su secuencia primaria con otras proteínas reveló que YesT es un nuevo miembro de la familia de las SGNH hidrolasas. Presenta un plegamiento sándwich. El diagrama topológico de YesT puso de manifiesto la divergencia de todos los miembros de la familia SGNH hidrolasa desde un ancestro común. Esta divergencia parece haber ocurrido en dos líneas topológicas diferentes, en una de las cuales sus miembros presentan hojas adicionales a la hoja central. Además, una Acetil xilan esterasa procedente de Bacillus pumilus fue clonada y caracterizada sobre sustratos cefalosporánicos. Por otro lado, se desarrolló un método colorimétrico, basado en un indicador de pH, para evaluar las actividades Acetil xilan esterasa y Cefalosporin deacetilasa utilizando como sustratos 7-ACA, CPC y xilano. El método ha sido validado para su aplicación en high-troughput screening, permitiendo evaluar librerías procedentes de experimentos de evolución dirigida o metagenómica. Para modificar la posición 7 de la cefalosporina, una Glicina oxidasa procedente de Bacillus subtilis (GOXB) fue clonada y caracterizada. GOXB no fue capaz de actuar sobre la cefalosporina, por ello se generaron los mutante M261Y y M261H, poniendo de manifiesto la implicación de este residuo en la modulación de la especificidad de sustrato. Ambos mutantes presentaron una disminución en el valor de la KM sobre todos los sustratos analizados, pero no fueron activos sobre la cefalosporina. El mutante M261Y presentaba un valor de KM sobre el sustrato N-etil-glicina tan bajo que aventura una función similar a la descrita para la enz