Identificación y caracterización de una glicina oxidasa en Marinomonas mediterranea perteneciente a una nueva familia de qinoproteínas

Resumen

Resumen Tesis doctoral de Jonatan C. Campillo Brocal para TESEO Las L-aminoácido oxidasas (LAOs) son flavoproteínas que oxidan L-aminoácidos en posición alfa y producen el cetoácido correspondiente, amonio y peróxido de hidrógeno, que les proporciona cierta capacidad antimicrobiana. Están ampliamente distribuidas a lo largo de la escala evolutiva y están implicadas en procesos como la defensa innata de peces, sistema inmune de humanos, desarrollo de biofilms bacterianos, etc. El estudio de las LAOs tiene un gran interés en campos como la biomedicina y son importantes a nivel biotecnológico, ya que pueden ser aplicadas en el desarrollo de biosensores, en la producción de antibióticos, en biotransformaciones, etc. La enzima LodA sintetizada por Marinomonas mediterranea ha sido la primera aminoácido oxidasa descrita que no es una flavoproteína, sino que presenta cofactor quinónico de tipo cisteína triptofilquinona (CTQ) generado por modificación post-traduccional de ciertos residuos en la misma proteína. LodA es una novedosa L-lisina ?-oxidasa (EC 1.4.3.20) que presenta una gran estabilidad y alta especificidad frente a L-lisina. Está codificada por el gen lodA que forma parte del operón lod junto a lodB, gen que codifica una flavoproteína que interviene en la generación del cofactor de LodA. El mutante LD de M. mediterranea, con una deleción del operón lod, pierde totalmente la actividad lisina oxidasa. Análisis bioinformáticos han puesto de manifiesto la presencia de varios genes similares a lodA en diversos genomas microbianos, así como dos de ellos en el genoma de M. mediterranea, anotados como que codifican proteínas hipotéticas de función desconocida. Estas observaciones suponen el punto de partida de este trabajo que tiene como objetivo principal estudiar si los genes similares a lodA codifican nuevas oxidasas no caracterizadas hasta la fecha. En este estudio se ha identificado y caracterizado una nueva proteína en M. mediterranea con actividad glicina oxidasa (GOX) denominada GoxA, que presenta notables diferencias con las glicina oxidasas descritas en la bibliografía. Por un lado es más específica para la glicina, y por otro, no une FAD sino que presenta cofactor quinónico de tipo CTQ. Está codificada por el gen goxA, uno de los dos genes similares a lodA detectados en el genoma de M. mediterranea. goxA forma un operón junto con goxB, gen que codifica una flavoproteína similar a LodB. Hemos identificado el inicio de la transcripción, así como la región promotora de dicho operón y se ha comparado con el del resto de oxidasas de Marinomonas. El operón gox ha sido expresado de forma recombinante en varias cepas de E. coli. La fusión de GoxA a una etiqueta de poli-his ha permitido la purificación de la proteína recombinante y su posterior caracterización. El estudio de la regulación del operón gox pone de manifiesto la presencia de elementos comunes que intervienen en la expresión de las actividades oxidasa de M. mediterranea, como por ejemplo el sistema de dos componentes PpoS/PpoR. Por otro lado, hemos demostrado que tgox2, gen similar a goxA presente en el genoma de Thalassobaculum salexigens, codifica una glicina oxidasa con idénticas propiedades a GoxA. Esta observación apoya nuestra hipótesis inicial. Nuestro estudio revela que las proteínas similares a LodA constituyen una nueva familia de quinoproteínas con actividad oxidasa que están ampliamente distribuidas en microorganismos. Todas ellas muestran conservados los residuos de cisteína y triptófano que forman parte del cofactor CTQ en LodA y GoxA. En definitiva, este trabajo supone una plataforma para estudiar el mecanismo de modificación post-transcripcional implicado en la formación del cofactor CTQ, así como para explorar las posibles nuevas actividades de las proteínas similares a LodA/GoxA cuyo estudio puede derivar en novedosas aplicaciones biotecnológicas. Summary of Jonatan C. Campillo Brocal doctoral thesis for TESEO L-amino acid oxidases (LAOs) are flavoproteins oxidizing L-amino acids in alpha position to generate the corresponding keto acid, ammonium and hydrogen peroxide, which confers to them antimicrobial activity. They are widespread in organisms, from bacteria to mammals. They are involved in distinct processes, such as bacterial biofilm development, protection of fish skin bacterial infections and participation in the human immune system. Studying LAOs is of a broad interest in biomedicine and in relation to their biotechnological applications since they can be applied in biosensor development, antibiotics production and biotransformation. LodA enzyme synthetized by Marinomonas mediterranea has been the first amino acid oxidase described that is not a flavoprotein but presents a cysteine tryptophylquinone (CTQ) cofactor, which is generated by post-translational modification of residues in the same protein. LodA is a novel L-lysine epsilon-oxidase (EC 1.4.3.20) very stable and specific for L-lysine. It is encoded by lodA gene, which forms the lod operon together with lodB, gene encoding a flavoprotein related with the LodA cofactor generation. M. mediterranea strain with lod deletion, LD mutant, lacks completely lysine oxidase activity. Bioinformatics reveal diverse genes similar to lodA in different bacterial genomes, as well as two of them in M. mediterranea, which are annotated to encode hypothetical proteins with unknown function. Those observations represent the beginning of this work, which pretends to study whether operons similar to lod could encode a novel family of enzymes with amino acid oxidase activity. A new protein with glycine oxidase activity has been identified characterized in M. mediterranea. It is named GoxA and differs from conventional glycine oxidases in terms of substrate specificity and type of cofactor. Especially, it is much more specific for glycine and not bind FAD but contains a CTQ cofactor. GoxA is encoded by the goxA gene that forms part of an operon with a second gene, goxB, which codes for a flavoprotein necessary to generate active GoxA. We identified the initial transcription site of gox operon, as well as its promoter that exhibits potential regulatory elements. gox operon has been successfully expressed in various E. coli strains. Conditions for induction were optimized and GoxA fused to a poly-His tag in N-terminus was expressed. This tag, which did not affect to GOX activity, has permitted the isolation and characterization of the recombinant enzyme. Our results show that both native and recombinant proteins share similar properties. The study of gox regulation has indicated the presence of some common elements, such as the two-component regulatory system PpoS/PpoR, which are involved in the expression of every M. mediterranea oxidase. GOX activity has been also detected in the alphaproteobacteria Nisaea denitrificans and Thalassobaculum salexigens. In the latter, the activity was associated to TGox2, a GoxA similar protein. Both GoxA and TGox2 seem to be comparable proteins since they display similar characteristics, such as substrate specificity and CTQ cofactor presence. Our results have revealed the existence of a novel family of quinoproteins similar to LodA, with oxidase activity, which are widespread in many different groups of bacteria. Sequence alignment of LodA-like proteins allowed the detection of several conserved domains and residues, such as the cysteine and tryptophan that are forming part of the CTQ cofactor in LodA and GoxA. Furthermore, LodA-like proteins are encoded by an operon that contains a second gene similar to lodB, which could be related with the correct expression of the LodA-like protein located in the same operon. In conclusion, this study provides a platform to explore the potentially novel enzymatic activities of the proteins detected, the mechanisms of post-translational modifications involved in their synthesis, as well as their biological relevance.