Purificacion y caracterizacion cinetica de oxidasas de aerococcus viridans implicadas en el metabolismo del glicerol

Abstract

El crecimiento de un microorganismo como Aerococcus viridans con glicerol como única fuente de carbono, induce la síntesis de las enzimas glicerol fosfato oxidasa y lactato oxidasa. Cuando hay altos niveles de estas enzimas, el glicerol es rápidamente convertido a fosfato de dihidroxiacetona. Este último activa la ruta de síntesis de metilglioxal y genera fósforo inorgánico. El objetivo general de este trabajo es purificar las enzimas lactato oxidasa y glicerol fosfato oxidasa para proceder posteriormente a su caracterización cinética y estudio. Para lo cual se optimizaron las condiciones de crecimiento de microorganismo para la máxima producción enzimática, se desarrollo un sistema de purificación para ambas enzimas y se realizo la coinmobilización de laenzima glicerol fosfato oxidasa y de Aerococcus viridans con catalasa para la producción de fosfato de dihidroxiacetona. La enzima lactato oxidasa fue purificada con una primera digestión con lisozima y Triton X-114, una posterior clarificación con CTAB, una precipitación con sulfato amónico y finalmente una columna de intercambio iónico. El grado de purificación obtenido fue de 32 veces, con una recuperación el 60% de la actividad enzimática y una actividad específica de 114.5 UE/mg proteina.La enzima purificada presento un aperente peso molecular de 48000 en condiciones disociantes en un gel de policacrilamida y el peso molecular de la enzima en su forma nativa, estimado por filtración en gel, de policacrilamida y el peso molecular de la enzima en su forma nativa, estimado por filtración en gel, fue de 187000 encontrándose en forma tetramérica. En cuanto a los inhibidores utilizados, se desarrollo un detallado estudio cinético de Cibacron Blue 3GA, que presento un tipo de inhibición dependiente del tiempo y pH. Luego de la obtención de la apoenzima de lactato oxidasa, esta se recuperó totalmente con la adición de FMN o FAD, observándose una afinidad 51 v