Estudios moleculares sobre la melanogénesis en marinomonas mediterranea. Caracteización del operón ppob

Résumé

Marinomonas mediterranea es una bacteria marina, Gram negativa, que sintetiza melaninas a partir de L-tirosina. Es el primer procariota descrito que expresa todas las actividades enzimáticas PPO caracterizadas hasta ahora. No obstante, las actividades enzimáticas típicas de tirosinasas como son cresolasa y catecol oxidasa son específicamente activadas en presencia de SDS en los extractos celulares. Tratamientos de la bacteria con el agente mutagénico nitrosoguanidina permitieron obtener mutantes afectados en las actividades enzimáticas típicas de tirosinasa activables por SDS pero que conservan las demás actividades (DMPO, SO, TH, DO). Estos mutantes, como la cepoa ng56 son incapaces de producir melanina. Posteriores ensayos bioquímicos purificaron ambas enzimas por separado. La tirosinasa presenta las actividades cresolasa y catecolasa típicas de las tirosinasas. Es activable por SDS. Esta enzima se encuentra mayoritariamente en la fracción soluble de los extractos celulares. Existe otra enzima PPO adicional asociada a membrana con una amplia afinidad por diferentes sustratos. Predomina en ella la actividad lacasa, aunque también posee cierto grado de actividades TH y DO no activables por SDS. Con el fin de intentar clonar el gen que codifica la tirosinasa se obtuvo un mutante de esta bacteria mediante transposición al que se denominó T101. El transposón truncó el gen que codificaba la enzima multipotente de membrana, lo que permitió la clonación y secuenciación de dicho gen. El gen se denominó ppoA, y fue el primer caso descrito de clonación de una lacasa bacteriana. El hecho de que el mutante T101 sea capaz de producir melanina indica que PpoA no es la principal enzima responsable de la melanogénesis en Marinomonas mediterranea. En esta tesis se ha obtenido un segundo mutante amelanogénico mediante transposición llamado T105 permitió clonar el gen (ppoB1) que codifica la enzima tirosinasa soluble activable