Estudios cinéticos sobre el mecanismo de reacción, actividades catalíticas y aplicaciones analíticas de tirosinasa

Resumen

En esta memoria se aborda el estudio de la enzima tirosinasa de champiñón bajo distintos enfoques. En primer lugar se revisan los métodos espectrofotométricos descritos en la bibliografía para medir las actividades monofenolasa y difenolasa, profundizando sobre la validez de cada método desde un punto de vista cinético y apoyándonos para ello con la integración numérica. Además, se considera la unidad de expresión de ambas actividades discutiendo la relación entre ambas. Se ha profundizado en el mecanismo de acción de la enzima. Este estudio ha llevado a definir un nuevo parámetro cinético como es la constante de Michaelis para un o-difenol cuando la enzima actúa sobre el monofenol correspondiente. Se ha extendido este estudio a enzimas de distintas fuentes biológicas. Se ha conseguido establecer una expresión cuantitativa aproximada para el periodo de retardo que muestra esta enzima cuando actúa sobre monofenoles. También se ha estudiado la acción conjunta de tirosinasa y peroxidasa en las etapas inciales de melanogénesis. Tirosinasa es una enzima con poca especificidad de sustrato, esto ha hecho posible la caracterización de distintas actividades de la enzima como son: catalasa, actuando sobre peróxido de hidrógeno; tetrahidropterina oxidasa, actuando sobre tetrahidropterinas; NADH oxidasa y tetrahidrofólico oxidasa. Se ha caracterizado el proceso de inactivación que sufre la enzima cuando actúa sobre sus sustratos: inactivación suicida. Así, se pone de manifiesto que este mecanismo es general, ya que tiene lugar cuando la enzima actúa sobre peróxido de hidrógeno, tetrahidropterinas, NADH y ácido tetrahidrofólico. Se ha demostrado que el ácido tetrahidrofólico es el sustrato suicida más rápido de los descritos hasta ahora. El conocimiento conseguido con esta reacción enzimática, se ha aplicado con fines analíticos en la determinación las absortividades molares de aductos tiol-difenol y en la determinación de cisteína y N-acetilcisteína por su capacidad de reacción con el producto de la reacción enzimática sobre o-difenoles, las o-quinonas.