Caracterización molecular de n-acetil-d-glucosamina 2-epimerasa de bacteroides ovatusuna enzima relevante en la síntesis de ácido siálico

Resumen

El ácido siálico es un compuesto de origen glucídico que se encuentra en algunas especies de bacterias y animales como componente de los polisacáridos y glucoconjugados de la superficie celular. Se sintentiza a partir de un un azúcar de 4 a 6 carbonos y el fosfoenolpiruvato mediante condensación aldólica. Entre sus principales funciones biológicas destaca su implicación en la determinación de la estructura de diversas macromoléculas y su participación en la transferencia de información entre células y en el reconocimiento celular. Su interés biotecnológico ha ido en aumento en los últimos años debido a que puede ser utilizado como precursor en la síntesis de ciertos antivirales contra la gripe (Zanamivir) y como suplemento alimenticio en leches maternas de origen sintético. El principal problema para su producción industrial es el elevado precio de su síntesis, por lo que se ha buscado una alternativa a la síntesis tradicional utilizando un proceso enzimático, en donde a partir de N-acetil-D-glucosamina se consigue la síntesis del ácido sialíco utilizando dos enzimas: N-acetil-D-glucosamina 2-epimerasa (que cataliza la epimerización reversible entre N-acetil glucosamina y N-acetil manosamina) y N-acetilneuraminato liasa (que cataliza la condensación aldólica entre N-acetil manosamina y piruvato para dar ácido siálico). De estas dos enzimas, N-acetilneuraminato liasa ha sido ampliamente estudiada y se han realizado experimentos de evolución dirigida para mejorar su eficiencia y selectividad. Sin embargo, estos experimentos no han podido ser realizado con N-acetil-D-glucosamina 2-epimerasa debido a la ausencia de un método continuo de medida que permita un screening eficaz. El objetivo de esta Tesis es la puesta a punto de un método de medida continuo para N-acetil-D-glucosamina 2-epimerasa que permita la realización de un screening de variantes generadas por evolución dirigida y, de esta forma, encontrar un mutante de ésta enzima con mejoradas características que permita un proceso de producción de ácido siálico mas eficiente y económico. Para ello se ha llevado a cabo la clonación y el analisis estructural, de la secuencia y filogenético de posibles deshidrogenasas capaces de actuar sobre la N-acetil manosamina producida por N-acetil-D-glucosamina 2-epimerasa, dando lugar asi, a un ensayo acoplado que se puede seguir fácilmente en un espectrofotómetro a 340 nm. Además se ha clonado y caracterizado una nueva N-acetil-D-glucosamina 2-epimerasa del patógeno Bacteroides ovatus y se ha puesto a punto un nuevo método continuo para su medida y screening, obteniendo dos mutantes mediante evolución dirigida, uno con mayor actividad específica que la enzima nativa y otro con menor requerimiento de ATP.