Control diferencial de la ruta de MAP quinasas de integridad celular por GTPasas de la familia Rho en Schizosaccharomyces pombe

Resumen

RESUMEN Las rutas de señalización mediadas por MAP quinasas (MAPK) tienen un papel fundamental en la respuesta de células eucariotas frente a estímulos ambientales. La levadura con fisión Schizosaccharomyces pombe representa un modelo particularmente adecuado para abordar estudios básicos sobre dichas rutas de señalización, debido a la gran homología funcional que existe entre sus circuitos reguladores y los de organismos superiores. En S. pombe, la ruta de MAPKs de integridad celular (CIP) participa en la regulación de numerosos procesos biológicos como la construcción de la pared celular, la citocinesis, la morfogénesis, la fusión de vacuolas durante el estrés hipotónico, y la homeostasis iónica mediante la modulación de la activación de la MAPK Pmk1 en respuesta a cambios en las condiciones ambientales. Aunque la GTPasa Rho2 es el principal activador de la ruta de integridad celular a través del ortólogo de PKC Pck2, Pmk1 puede ser activada en ausencia de ambos dependiendo de la naturaleza del estímulo recibido, lo que indica la existencia de elementos reguladores adicionales aguas arriba del módulo de MAPKs. Se ha propuesto a la GTPasa Rho1 como candidata para tal función, mientras que el ortólogo de PKC Pck1 parece regular negativamente la actividad de la CIP. Hemos investigado el posible papel de Rho1 y Pck1 como reguladores de la CIP empleando un mutante hipoactivo de Rho1 (rho1-596) y un mutante carente de Pck1 en distintos fondos genéticos. Las evidencias obtenidas mostraron que Rho1 y Pck1 son activadores de la ruta adicionalmente a Rho2 y Pck2, lo que pone de manifiesto la naturaleza ramificada de los mecanismos de señalización que actúan aguas arriba del módulo de MAPKs. Por otra parte Rho2 se localiza en la membrana plasmática y en el área de división celular, y es farnesilada in vivo en el motivo -CAAX de su extremo C-terminal, siendo esta modificación esencial para su localización y función activadora de la CIP. Sin embargo, la presencia de un residuo de cisteína previo al motivo -CAAX sugiere que Rho2 podría encontrarse palmitoilada en dicho residuo. Para estudiar la relevancia biológica de la palmitoilación de Rho2 creamos una serie de cepas que expresan versiones mutantes tanto de Rho2 como de Rho1 afectadas en lipidación, y estudiamos su localización y función biológica. Los resultados obtenidos permitieron concluir que en la levadura con fisión, la GTPasa Rho2 es palmitoilada in vivo, siendo esta modificación crítica para su correcta localización en membrana plasmática y para ejercer su regulación de la morfogénesis y la ruta de integridad celular. Por último, son numerosos los estudios que han puesto de manifiesto la importancia de la localización subcelular de los componentes de los módulos de MAP quinasas en la respuesta a estrés. En el caso de la ruta de integridad celular, la MAPK Pmk1 muestra una localización núcleo/citoplasmática constitutiva, así como en el huso mitótico, el corpúsculo polar del huso, y en el septo durante la separación celular. Sin embargo, a diferencia del modelo descrito en ERK1/2 en mamíferos, el patrón de localización de Pmk1 no se modifica en respuesta a estrés, lo que indica que tanto la forma activa como inactiva de la MAP quinasa son capaces de entrar en el núcleo. En base a esto, nos planteamos el estudio de la relevancia biológica de la localización nuclear de Pmk1 sobre su función biológica. Para ello recurrimos a la caracterización de mutantes de S. pombe que expresan una versión de Pmk1 anclada a la membrana plasmática y excluida del núcleo constitutivamente en distintos fondos genéticos. Los resultados mostraron que aunque la localización nuclear de Pmk1 en Schizosaccharomyces pombe no es crítica para ejercer la mayor parte de sus funciones biológicas, sí es necesaria para la regulación transcripcional en respuesta al estrés de pared celular, lo que revela la importancia del control espacio-temporal de la actividad de las MAPKs en los organismos eucariotas. SUMMARY Mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathways play a fundamental role in the response of eukaryotic cells to environmental changes. Fission yeast Schizosaccharomyces pombe has emerged as an excellent model organism to study mechanisms and cellular events linked to MAPK activation, given the significant functional homology between their regulatory circuits and those of higher cells. In S. pombe the cell integrity pathway (CIP) participates in multiple biological processes like cell wall construction, vacuole fusion during hypotonic stress, cytokinesis, morphogenesis, and ionic homeostasis by fine tuning of MAPK Pmk1 activation in response to various environmental conditions. Although the small GTPase Rho2 is a main positive regulator operating upstream the CIP through protein kinase C ortholog Pck2, Pmk1 can still be activated in the absence of either Rho2 or Pck2 depending on the nature of the stimulus, suggesting the existence of additional upstream regulatory elements to modulate its activity. The essential GTPase Rho1 is a candidate to control the activity of the CIP, whereas Pck1 appears to negatively regulate Pmk1 activity. To study the role of Rho1 GTPase and PKC ortholog Pck1 in the CIP, we characterized a S. pombe mutant that expresses hypomorphic Rho1 allele (rho1-596) and a mutant lacking Pck1 in distinct genetic backgrounds. The evidences obtained in this study revealed that Rho1 and Pck1 are positive upstream activators of the CIP in addition to Rho2 and Pck2 during cell growth and cell wall stress. This model shows the branched nature of the upstream signal network that regulates the CIP. Rho2 positively regulates the CIP and is involved in the control of cell polarity and cell wall biosynthesis in fission yeast. Rho2 locates along the plasma membrane and the division area and it has been described that becomes farnesylated in vivo at its -CAAX motif. This lipid modification appears essential for both localization and function within the MAPK pathway. Moreover, there is a second conserved cysteine residue upstream the Rho2 CAAX motif which might be palmitoylated in vivo like other Rho GTPases such as human RhoB. To investigate the role of palmitoylation in Rho2-signaling we constructed rho2? strains expressing the wild type, unpalmitoylated, or unprenylated versions of Rho2 as well as Rho2 chimeras fused to the carboxyl end from the essential GTPase Rho1, and we study their location and Rho2-dependent signalling within the CIP. Our results showed that in fission yeast Rho2 becomes palmitoylated in vivo and this modification is required for plasma membrane localization and proper signaling to the CIP. Pmk1 is constitutively localized in both cytoplasm and nucleus, as well as in the mitotic spindle and septum during cytokinesis. However, contrary to the current model for ERK1/2, its localization pattern appears unaffected by its activation status. In this context, we questioned the biological significance of nuclear localization of MAPK Pmk1. We have addressed this issue by characterization of mutants expressing Pmk1 versions excluded from the cell nucleus and anchored to the plasma membrane in different genetic backgrounds. We have found that nuclear localization of Pmk1 is not critical to exert their biological functions, although its presence in the nucleus is necessary for transcriptional regulation under cell wall stress. These evidences highlight the relevance of the spatial/temporal activity control of MAPK activity in eukaryotes.