Análisis de la degeneración de los fotorreceptoes en modelos experimentales de retinosis pigmentaria, degeneración macular asociada a la edad y glaucoma

Resumen

RESUMEN. Objetivo. Determinar el número total y la topografía de la población de conos en roedores adultos utilizando rutinas automatizadas que nos permita investigar objetivamente los efectos de diferentes modelos experimentales de patologías humanas tales como la degeneración macular asociada a la edad (DMAE), retinosis pigmentaria (RP) y la neuropatía óptica glaucomatosa (NOG) sobre la población de fotorreceptores. Material y métodos. Se han utilizado cinco cepas distinta de roedores: Sprague-Dawley (SD), Piebald Virol Glaxo (PVG) y la rata transgénica P23H-1, y ratones Swiss y C57/BL6. Todos los experimentos y procedimientos se han realizado bajo el estricto cumplimiento de las recomendaciones de la "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals of the Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO)" y la "European Union guidelines for the use of animals in research", y todos los procedimientos utilizados han sido previamente aprobados por el Comité Ético de Experimentación Animal (CEEA) de la Universidad de Murcia. Se han utilizado diferentes técnicas para el estudio histológico y morfológico y se han analizado en retinas montadas a plano y en secciones transversales; se han utilizado tecnologías de imagen avanzadas como la Spectral Domain Optical Coherence Tomography (SD-OCT)y se ha realizado análisis de proteínas mediante Western Blot. Como modelo de RP se ha utilizado la rata transgénica P23H-1, esta rata es portadora de una mutación autosómica dominante en el gen de la rodopsina que causa distrofia y muerte de los fotorreceptores. Se ha desarrollado un nuevo modelo experimental útil para la comprensión de la patología de la DMAE, la fototoxicidad localizada de los fotorreceptores tipo cono inducida por LED (FTIL). Por último se ha utilizado un modelo experimental de hipertensión ocular (HTO) inducida mediante láser que permite la evaluación de los efectos de la NOG sobre la población de fotorreceptores. Resultados. El número medio de conos que expresan la opsina-L es de 231.736 ± 14.517 en la rata SD; 239.939 ± 6.494 en la rata PVG; 117.424 ± 17.721 en el ratón Swiss y 135.155 ± 8.742 en el ratón C57/BL6. El número medio de conos que expresan la opsina-S es de 41.028 ± 5.074 en la rata SD; 27.316 ± 2.235 en la rata PVG; 146.682 ± 24.958 en ratones Swiss y 119.616 ± 8.756 en ratones C57/BL6. El porcentaje de conos duales en la rata SD es del 3,2%, del 2,9% en la PVG, de un 73% en el ratón Swiss y de un 40% en el C57/BL6. En todas las cepas de ambas especies existe un paralelismo en la distribución de las células ganglionares de retina (CGR) y los conos-L. La topografía de los conos-L en todas las cepas de rata y ratón analizadas es similar, se observan zonas de alta densidad en el eje nasotemporal superior, las densidades medias alrededor del nervio óptico y un descenso de densidad gradual desde las zonas centrales hacia las periféricas. Sin embargo, existen claras diferencias en la distribución de los conos-S entre las especies y cepas analizadas. El la rata P23H-1, la degeneración de los bastones ocurre antes que la de los conos y de forma rápida: primero con el acortamiento de los segmentos externos, a P30 existe una gran pérdida de bastones y a P180 la pérdida es prácticamente en la totalidad de la retina exceptuando la extrema periferia. La degeneración de bastones y conos está espaciotemporalmente relacionada, ocurre en forma de anillos que aparecen alrededor de P90 y se extiende por toda la retina. A P180, los anillos de degeneración son más abundantes en la retina ecuatorial y de mayor tamaño en la retina dorsal. En un nuevo modelo in vivo de fototoxicidad focal de los fotorreceptores inducido por LED, la SD-OCT muestra un daño en una región circular situado en la retina superotemporal. En esta región se observa una disminución progresiva del espesor de la retina desde 183,4 ± 5 mm (12 h) hasta 114,6 ± 6 mm (7 d). Las secciones transversales muestras una pérdida masiva de bastones y conos en la región dañada por la luz. En las retinas montadas a plano se observa una región circular con disminución del número de conos-L y conos-S. En este área circular en las retinas izquierdas y en la región correspondiente de la retina control derecha, el número total de conos-L o conos-S es de 7.118 ± 842 ó 661 ± 125 en las retinas fotoexpuestas (n=7) y de 14.040 ± 1.860 ó 2.255 ± 193 en las retinas control (n=7), respectivamente. Aunque el CNTF no, la brimonidina, el BDNF, PEDF y el bFGF muestran efectos neuroprotectores significativos sobre los conos-L y conos-S. La HTO provoca sectores con su vértice en el disco óptico carentes de CGR Brn3a pero que aún contienen gran número de núcleos DAPI positivos. Los niveles de todas las opsinas disminuyen a las 2 semanas y esta disminución progresa hasta el 20% de los niveles basales a los 3 meses. Las secciones transversales revelan áreas focales de degeneración en las capas externas de la retina (CER). Las CGR supervivientes a los 15 días representan aproximadamente el 28% y no cambian con el tiempo, mientras que de las poblaciones de conos-L y conos-S sobreviven un 80% y un 65% a un mes o un 35% y un 20% a 6 meses, respectivamente. Conclusiones. Se ha establecido, por primera vez, el número total y la distribución topográfica de los conos-L y conos-S en dos cepas de rata y dos de ratón y se ha demostrado el paralelismo topológico de la distribución de los conos-L y las CGR. Se han proporcionado las bases para estudiar la degeneración de conos y su prevención en condiciones patológicas. Se ha descrito por primera vez que, en la rata P23H-1, la degeneración de bastones y conos está espaciotemporalmente relacionada y se produce en anillos. La pérdida de conos sigue a la pérdida de bastones, que comienza de forma temprana, incluso antes de P30, la primera edad analizada. Las características de los anillos sugieren que la degeneración secundaria de conos está influenciada por la localización en la retina y / u otros factores intrínsecos o extrínsecos. Se ha evidenciado que la FTIL provoca una pérdida de conos y bastones y es un modelo fiable, cuantificable y reproducible para estudiar la degeneración de los fotorreceptores. La administración intravítrea de BDNF, PEDF o bFGF, o la administración tópica de brimonidina proporcionan neuroprotección significativa sobre los conos, en este modelo. Se ha demostrado que la HTO induce una pérdida selectiva de CGR en la capa de la CGR que no progresa después de 1 mes, mientras que los conos-L y conos-S presentan una pérdida progresiva hasta los 6 meses. Por lo tanto, HTO provoca graves daños tanto en las capas más internas como en las CER.