Análisis y discriminación entre sustratos e inhibidores de tirosinasa

Resumen

RESUMEN OBJETIVOS: Los objetivos fundamentales de esta Tesis Doctoral consisten en la profundización en el mecanismo de actuación e inhibición de la enzima tirosinasa, teniendo en cuenta las actividades monofenolasa y difenolasa, además del establecimiento de una metodología que permita discernir entre moléculas fenólicas inhibidoras y sustratos alternativos de la enzima. También la identificación y caracterización cinética como sustratos de algunas de las moléculas descritas como inhibidores de tirosinasa y usadas como tales en la industria cosmética y / o alimentaria. METODOLOGÍA: Ensayos espectrofotométricos, para realizar medidas de actividad monofenolasa y difenolasa de tirosinasa y estudiar su inhibición; ensayos oximétricos, para realizar medidas de actividad de tirosinasa siguiendo el consumo de oxígeno, cosustrato de la enzima; ensayos de RMN, para determinar los valores de desplazamiento químico los átomos de carbono de las moléculas de interés; ensayos de simulación, para comprobar la validez de los resultados obtenidos experimentalmente; docking computacional, para entender los modos de unión de tirosinasa a distintos ligandos; cromatografía de proteínas en FPLC, para la purificación de la tirosinasa comercial; análisis por regresión lineal y no lineal. CONCLUSIONES: Se ha establecido un diseño experimental que permite discernir entre moléculas fenólicas inhibidoras y sustratos alternativos de tirosinasa, teniendo en cuenta las actividades monofenolasa y difenolasa de la enzima. Las medidas de actividad monofenolasa se deben realizar añadiendo al medio de reacción la cantidad de o-difenol necesaria para suprimir el periodo de retardo que aparece al inicio de los registros de actividad. Siguiendo esta metodología, se han identificado los compuestos alcohol p-hidroxibencílico, tirosol, floretina y floricina como sustratos alternativos de tirosinasa. Se han identificado como sustratos de la enzima a los compuestos 4-hexilresorcinol, descrito como inhibidor y usado en la industria cosmética y alimentaria como despigmentante y antipardeante, y oxiresveratrol, propuesto para los mismos fines debido a su ya descrito efecto inhibidor sobre esta enzima. Estas moléculas son hidroxiladas por la enzima y posteriormente oxidadas a una o-quinona que rápidamente isomeriza a una p-quinona, más estable. Además, estos sustratos han sido caracterizados cinéticamente, llegando a la obtención de los parámetros cinéticos KM (constante de Michaelis) y kcat (constante catalítica). Mediante métodos espectrofotométricos se ha identificado como sustrato de tirosinasa al ácido elágico, compuesto descrito como inhibidor y usado como despigmentante en la industria cosmética. Se ha llevado a cabo su caracterización cinética como sustrato, llegando a la obtención de los valores de KM y kcat. Se ha determinado que el ácido elágico inhibe la ruta de biosíntesis de melaninas por su efecto antioxidante, reaccionando con el anión superóxido, las o-quinonas y semiquinonas producidas durante el proceso. Se investigó el mecanismo de actuación de inhibidores análogos a sustratos fenólicos de tirosinasa, llegando a la conclusión de que aquellos que producen el mismo grado de inhibición en las actividades monofenolasa y difenolasa, se unen a las mismas especies enzimáticas en ambas actividades, siendo el tipo y las constantes de inhibición aparentes también similares. Se estableció una metodología para el estudio de inhibidores de tirosinasa y se observó que los valores de muestran una ligera dependencia de la naturaleza del sustrato, a través de las constantes k2 y k6. Finalmente, se estudió el efecto del pH en la catálisis de tirosinasa. Se propuso que un grupo con un pKa de 4.63 ± 0.04 podría ser el responsable de dicho efecto. Este grupo podría corresponder al ácido glutámico E322, que controlaría el acceso de los sustratos al sitio activo según su estado de protonación. Los protones actúan como inhibidores competitivos, uniéndose a las formas metatirosinasa y oxitirosinasa. El pKa de los hidroxilos fenólicos y la carga de grupo R también son importantes.