Production and molecular characterization of NAD+ related enzymes and their advanced intermediates

Resumen

En la Tesis Doctoral titulada "Producción y caracterización molecular de enzimas relacionadas con NAD+ y sus intermedios avanzados", los objetivos fueron: el desarrollo de un método enzimático para la obtención de nicotinamida mononucleótido (NMN) y nicotinamida ribósido (NR); el diseño de un método de cribado funcional para la obtención de nicotinamidasas/pirazinamidasas en librerías metagenómicas/ poligenómicas; la aplicación del método de cribado desarrollado para encontrar nuevas nicotinamidasas/pirazinamidasas metagenómicas en ambientes extremos; el análisis del genoma de la trufa negra para asignarle actividad nicotinamidasa/pirazinamidasa a una proteína no caracterizada en base a su caracterización funcional; y la caracterización bioquímica y estructural de una proteína no caracterizada de Oceanobacillus iheyensis como un nuevo macrodominio bacteriano. Para obtener NMN y NR puros, una difosfatasa de NAD+ y una 5'-nucleotidasa bacterianas se clonaron y purificaron. La primera enzima se utilizó para convertir NAD+ en NMN y AMP, siendo este último separado del NMN por cromatografía de intercambio iónico. El NMN obtenido se transformó en NR con la 5'-nucleotidasa. Asimismo, ambos compuestos fueron testados y comparados con la fuente comercial de NMN en dos modelos celulares, encontrando, por primera vez, un mejor incremento de los niveles de NAD+ en uno de los dos modelos tratado con nuestros compuestos. Para el cribado funcional de nicotinamidasas/pirazinamidasas se desarrollaron dos métodos basados en la reacción de los productos de reacción de las nicotinamidasas (el ácido pirazinoico y el ácido nicotínico) con el sulfato amónico ferroso (AFS) y el nitroprusato de sodio (SNP). Una vez establecidas las condiciones óptimas de los ensayos, se estudió una librería de fósmidos poligenómica, encontrando varios clones positivos con el método del AFS. La detección de actividad de forma cuantitativa con el método del SNP nos permitió descubrir la primera nicotinamidasa con actividad balanceada frente a nicotinamida y pirazinamida. Además, su caracterización bioquímica hizo posible el desarrollo de un método para el cribado de inhibidores de nicotinamidasas. Utilizando el método descrito anteriormente se descubrió la primera nicotinamidasa hipertermófila procedente de una bacteria no clasificada (UbNic), con una temperatura óptima de 90 °C y un amplio pH óptimo. La enzima mostró una de las eficiencias catalíticas más altas entre las nicotinamidasas de bacterias no patógenas. Asimismo, su secuencia de unión a metal fue descrita y catalogada en un subgrupo no descrito hasta ahora. Con el conocimiento adquirido en el campo de las nicotinamidasas, se realizó un análisis bioinformático con el fin de identificar un nuevo gen de trufa como una posible nicotinamidasa. La presencia del gen en el micelio del hongo se demostró con el método del AFS descrito anteriormente. Después de su expresión y purificación recombinante, se realizó una caracterización bioquímica de la proteína, la cual mostró una clara preferencia por nicotinamida frente a pirazinamida. Asimismo, la enzima mostró un patrón de inhibición característico frente a los diferentes aldehídos probados. Finalmente, la caracterización funcional y estructural del macrodominio de Oceanobacillus iheyensis nos permitió profundizar en el conocimiento de su mecanismo de catálisis y unión a sustrato. Las estructuras cristalinas de los mutantes D40A, N30A y G37V, así como las obtenidas con MES, ADP-ribosa y ADP, permitieron la identificación de cinco moléculas de agua encargadas de la unión a sustrato. Asimismo, se demostró que el cierre del lazo ?6-?4 es esencial para el reconocimiento del pirofosfato y la orientación de la ribosa distal. Además, se encontró que OiMacroD cataliza tanto la hidrólisis de O-acetil-ADP-ribosa como la eliminación de residuos de ADP-ribosa de proteínas ribosiladas. Finalmente, el estudio del mutante G37V demostró la participación de una molécula de agua coordinada con el sustrato que ayuda a mantener la correcta conformación del mismo.