Characterization of new molecules and enzymes involved in the regulation of NAD+ levels

Resumen

En la Tesis Doctoral titulada "Caracterización de nuevas moléculas y enzimas que regulan los niveles de NAD+", los objetivos fueron; el diseño de un método para la clasificación del gran número de nicotinamidasas presentes en las bases de datos; el desarrollo de un método para la producción biotecnológica de compuestos precursores del NAD+, usando una nueva NAD+ difosfatasa bacteriana; el estudio in silico y posterior caracterización de una nueva NAD+ difosfatasa no bacteriana; la caracterización de una poli-ADP-ribosa polimerasa bacteriana con alta eficiencia catalítica; y la caracterización de un macrodominio bacteriano, capaz de eliminar las modificaciones proteicas por polímeros de ADP-ribosa. Para la clasificación de los miembros de la familia de las nicotinamidasas, un nuevo patrón compatible con Prosite fue desarrollado. Este patrón basado en el sitio de unión a metal, común a todas las nicotinamidasas, permitió identificar más de diez mil secuencias. Basados en este patrón, otros cuatro nuevos patrones más específicos fueron desarrollados, incluyendo el tipo Firmicutes, Mycobacteria, Archaea y Multi-origen. La clasificación establecida en base al sitio de unión a metal correlaciona bien con la obtenida al considerar las secuencias completas, indicando este sistema como un método útil para la clasificación de nicotinamidasas. Para la producción de precursores de NAD+, una nueva NAD+ difosfatasa bacteriana fue purificada e inmovilizada en forma de BSA-CLEAs. El importante incremento en su estabilidad operacional y reusabilidad tras la inmovilización hicieron posible su aplicación para la producción de precursores de NAD+ (NMN). El uso combinado de esta enzima con una NMN deamidasa de E. coli, permitió una sencilla producción de NaMN. Este compuesto fue testado en dos líneas celulares diferentes de hepatocitos y adipocitos, produciendo un claro incremento en los niveles de NAD+. Siguiendo con el interés despertado por la producción de precursores de NAD+, una nueva NAD+ difosfatasa obtenida de hongos fue caracterizada bioquímicamente, tras un profundo estudio bioinformático. La enzima alcolófila, mostró una alta eficiencia catalítica, varias veces superior a la de las enzimas descritas en la bibliografía incluyendo las bacterianas, con excepción de la humana NUDT12. Sin embargo, la razón de eficiencia catalítica NAD+/NADH fue mayor en la enzima aislada en esta tesis que en la enzima humana, señalando el potencial biotecnológico de esta nueva enzima. La búsqueda de una nueva poli-ADP-ribosa polimerasa bacteriana condujo al descubrimiento de la enzima de Clostridioides difficile CD160 (CdPARP). Esta posee una alta actividad, que es tres veces superior a la de la enzima descrita de la bacteria Herpetosiphon auranticus. Además, se llevó a cabo un análisis filogenético de PARPs bacterianas, mostrando una organización de dominios atípica en CdPARP comparada con otras enzimas de clostridios. Esto puede ser debido a una larga divergencia de C. difficile CD160, relacionada con la presencia de un toxigenotipo único (A-B+CDT-). Este organismo tiene gran interés, debido a su capacidad de un metabolismo de PAR completo, apoyado no solo por una poli-ADP-ribosa polimerasa y una PAR glicohidrolasa, sino también por un macrodominio. El mayor hito de este estudio fue el descubrimiento de un nuevo inhibidor, altamente selectivo para la PARP1 humana. Finalmente, un nuevo macrodominio bacteriano de Fusobacterium mortiferum ATCC 9817 fue descrito, siendo el primero de origen bacteriano en pertenecer al tipo OARD1. Los macrodominios del tipo OARD1 se caracterizan por ser capaces de catalizar tres reacciones enzimáticas distintas, la desacetilación de OAADPr, de-MARilación y de-PARilación. La capacidad de este nuevo macrodominio para eliminar las modificaciones de poli-ADP-ribosa es de gran importancia, debido a que esta actividad solo ha sido descrita en un macrodominio humano (hOARD1).