Catálisis y regulación de tirosinasa ante fenonas, arbutinas y ácidos hidroxicinámicos

Resumen

OBJETIVOS: En esta tesis se han marcado como objetivos profundizar en el conocimiento del mecanismo de acción de tirosinasa, así como desarrollar un método que sea fiable para distinguir los verdaderos sustratos alternativos, activadores e inhibidores de la enzima. METODOLOGÍA: Se realizaron las siguientes técnicas: aislamiento, concentración y purificación de tirosinasa, sirviéndonos de FPLC o microgeles de electroforesis, para disponer de una isoenzima purificada; caracterización de la actividad, y regulación por inhibición e inactivación enzimática de tirosinasa, utilizando sustratos cromogénicos y fluorogénicos y ensayos de absorbancia mediante espectrofotometría ultravioleta/visible; optimización de métodos cromatográficos con detección mediante espectrometría de masas (GC-MS y HPLC-MS), para la identificación y cuantificación de biomoléculas; ensayos de RMN, para obtener valores de desplazamiento químico y acoplamiento molecular computacional o docking, para entender los modos de unión de tirosinasa con distintos ligandos; y, finalmente, cuantificación de la fiabilidad de los resultados experimentales obtenidos mediante parámetros de estadística descriptiva y pruebas de significación estadística. CONCLUSIONES: Gracias al desarrollo de esta tesis, se ha avanzado en el estudio del mecanismo cinético y estructural de la enzima tirosinasa, y se han establecido criterios cinéticos para distinguir entre sustratos alternativos, activadores e inhibidores, siendo además los mecanismos propuestos, apoyados y confirmados por los estudios de docking. De este modo, se confirmó que las 3-4/-aminoacetofenonas son realmente inhibidores, a pesar de exhibir activación o inhibición en función de la cantidad de L-dopa utilizada en los ensayos; un hecho que se justifica por la formación de un aducto de mayor absorbancia que el dopacromo. Se confirmó el compuesto 2,2',4,4'-tetrahidroxibenzofenona (Uvinul D50) como inhibidor de la enzima, estableciendo como nuevas constantes de inhibición aparente e IC50 los valores de 2.02 ± 0.09 mM y 3.82 ± 0.39 mM, respectivamente. También se estudió la acción de tirosinasa sobre los ácidos cafeico y p-cumárico, mediante nuevos métodos que evitaran interferencias por la inestabilidad de los compuestos generados, y que así, permitieran su correcta caracterización cinética. Posteriormente se estudiaron los agentes despigmentantes, α y β-arbutina, y su derivado la desoxiarbutina en sendos artículos, comprobando que ambos casos se tratan realmente de sustratos alternativos de la enzima, hecho que debe ser tenido en cuenta para su aplicación en cremas cosméticas. Además, se demostró que la desoxiarbutina es el único sustrato de tirosinasa descubierto hasta el momento que no libera o-difenol al medio después de la hidroxilación. El siguiente estudio fue realizado acerca de la acción de tirosinasa sobre ácido cafeico y su n-nonil éster, el n-nonil cafeato, que resultaron ser sustratos suicidas que inactivan la enzima, siendo el cafeato más potente que el cafeico en este aspecto. Finalmente, se estudió la acción de tirosinasa sobre ácido cinámico y algunos de sus derivados, comprobando que los ácidos cinámico, 2-hidroxicinámico, 2,3 y 4-metoxicinámico son inhibidores de tirosinasa, mientras que los ácidos 3-hidroxicinámico, 4-hidroxicinámico y 3,4-dihidroxicinámico actúan como sustratos de tirosinasa. Además, se caracterizó cada uno de ellos con sus correspondientes constantes cinéticas.