Desarrollo de métodos rápidos para la detección de alicyclobacillus spp. en materia prima destinada a la elaboración de bebidas y zumos de frutas

Resumen

Resumen Alicyclobacillus acidoterrestris es una bacteria termoacidófila, formadora de esporas que crece a una temperatura entre 26 y 60 ºC (con un rango óptimo de temperatura 42-53 ºC) y en un rango de pH de 2,0 a 6,0 con valores óptimos entre 3,5 y 5,0. Es una bacteria termorresistente que puede crecer en alimentos ácidos, incluyendo zumos y bebidas de frutas, y supone un gran problema para la industria de este sector, ya que el deterioro del zumo por este microorganismo no es perceptible en el producto final al crecer sin formación de gas, pero origina sabores desagradables que alteran el producto, como un "sabor a medicina". Su detección, plantea dificultades en los departamentos de calidad ya que son necesarios varios días para la obtención de resultados por los métodos microbiológicos clásicos tradicionales. Por ello, es de gran importancia el desarrollo de métodos rápidos que permitan el control de Alicyclobacillus en las materias primas empleadas en la industria alimentaria garantizando así la ausencia de este microorganismo en los productos finales, zumos y bebidas de frutas. En la presente Tesis Doctoral el objetivo general ha sido estudiar la aplicación de dos métodos rápidos (impedancia eléctrica y PCR) para la detección de Alicyclobacillus spp. en distintas materias primas empleadas en la industria de zumos. Para ello se inocularon las materias primas (zumo concentrado de uva, zumo concentrado de manzana, zumo concentrado de piña, zumo concentrado de naranja, cremogenado de melocotón-nectarina, cremogenado de pera y zumo puro de naranja) con esporas Alicyclobacillus acidoterrestris aisladas a partir de un zumo de melocotón y uva, y con una cepa de referencia del mismo. En la primera experiencia se ensayaron distintos tratamientos térmicos (80 ºC/10 minutos, 70 ºC/20 minutos y 60 ºC/30 minutos) para la germinación de esporas a formas vegetativas, no existiendo diferencias significativas en los recuentos de Alicyclobacillus a las distintas concentraciones de inóculos, ni en los porcentajes de recuperación. Es por ello que se seleccionó el tratamiento térmico de 80 ºC/10 minutos para emplear así menos tiempo de análisis. La técnica de impedancia eléctrica válida para la detección de Alicyclobacillus acidoterrestris fue el método indirecto, que registró los cambios en la impedancia del medio (%M) a través de la formación de CO2 derivado de la ruta metabólica del guayacol por Alicyclobacillus, siendo el medio de cultivo más adecuado para la determinación de este microorganismo el caldo BAT. Por el contrario, no detectamos crecimiento por impedancia eléctrica directa. Para cada una de las materias primas, zumo concentrado de uva, zumo concentrado de manzana, zumo concentrado de naranja, cremogenado de melocotón-nectarina, cremogenado de pera y zumo puro de naranja, se desarrolló un método valido para la detección y cuantificación de Alicyclobacillus acidoterrestris por impedancia eléctrica indirecta para un valor de %M= -10, logrando unos coeficientes de correlación y varianza corregida elevados, superiores al 0,8 tanto para el experimento realizado con una cepa aislada de un zumo de melocotón y uva comercial e identificada como Alicyclobacillus acidoterrestris, como el efectuado con una cepa de referencia de Alicyclobacillus acidoterrestris. La validación de este método comparando con el método de microbiología clásica con BAM Agar resultó satisfactoria con valores de R2 > 0,9 para cada una de las matrices mencionadas. Sin embargo, para el zumo concentrado de piña este método no permitió una adecuada cuantificación, ya que se obtuvo baja correlación entre las variables tiempo de detección por impedancia y logaritmo de las unidades formadoras de colonias cuantificadas por siembra tradicional en placa con BAM Agar, tanto para el estudio realizado con la cepa aislada como en el realizado con la cepa de referencia. Además, este método tampoco pudo ser validado con el método clásico de microbiología con BAM Agar por obtener un valor muy bajo de varianza explicada, R2= 0,366. Con la técnica de RTi-PCR es posible determinar la concentración de Alicyclobacillus acidoterrestris en todas las materias primas utilizadas en este estudio destinadas a la elaboración de zumos y bebidas de frutas, obteniendo unos valores de coeficientes de correlación y varianza corregida superiores a 0,9; y estableciendo un límite de detección, cuantificado por fluorescencia, de CT < 40 que corresponde a límite de detección de 200 ufc/mL en recuento en placa, para todos los casos, incluso en el zumo concentrado de piña a diferencia de la técnica por impedancia eléctrica. Las características intrínsecas de composición química analizadas en las muestras: ºBrix, pH, glucosa, fructosa, sacarosa, pectinas solubles en agua, ácidos orgánicos, compuestos fenólicos y flavonoides no influyeron en el crecimiento de Alicyclobacillus spp., al no observar diferencias en el crecimiento del microorganismo entre las muestras, a excepción del zumo concentrado de piña. En el caso del zumo de piña, los resultados obtenidos en el método de impedancia eléctrica indirecta, pueden estar relacionados con la composición fenólica de este zumo que se caracteriza por un alto contenido en lignanos, compuestos considerados como antimicrobianos de hongos y algunas bacterias patógenas, que pudiera inhibir el crecimiento de Alicyclobacillus y por consiguiente la síntesis de guayacol y formación de CO2.