Estudio de la interacción física y funcional de la proteín fosfatasa dual MSG5 con MAP quinasas en "Saccharomyces cerevisiae"

Resumo

Las fosfatasas de especificidad dual (DUSPs) desempeñan un papel clave en la modulación de la activación de las rutas de transducción de señales mediadas por MAPKs. Dentro de este grupo se encuadra Msg5, una DUSP de Saccharomyces cerevisiae que se ex presa en la célula como dos isoformas de distinto peso molecular debido a la presencia de comienzos de traducción alternativos. En concreto, esta fosfatasa regula negativamente la activación de las MAPKs de la ruta de integridad celular, Slt2, y de l a ruta de apareamiento, Fus3, tanto en condiciones basales como de estimulación de ambas cascadas. En este trabajo, se ha comprobado que en ausencia de Msg5 se induce la expresión de genes regulados por la ruta de apareamiento y de integridad celular , lo cual indica que la actividad de esta fosfatasa regula la respuesta a daño en la pared y a la presencia de feromona. Sin embargo, los mutantes msg5?, aunque muestran una elevada fosforilación de Slt2, no muestran un elevado nivel de expresión de los genes regulados por la ruta de integridad celular. Es decir, que la fosforilación de la MAPK Slt2 ocasionada por la falta de Msg5 no se traduce en un aumento de la fosforilación de los sustratos sobre los que actúa; entre ellos, no se detecta fos forilación de Mkk1 o Msg5 dependiente de Slt2, ni del factor de transcripción Rlm1 y como consecuencia no se logra una respuesta transcripcional dependiente de Rlm1 plena. Ensayos de copurificación demuestran que la isoforma larga de Msg5 presenta más afinidad de unión a las MAPKs Fus3 y Kss1 que la isoforma corta, mientras que ambas isoformas interaccionan de manera similar con Slt2. Esta mayor afinidad de la isoforma larga se traduce en mayor actividad fosfatasa hacia la MAPK Fus3. A pesar d e que Msg5 es capaz de interaccionar con Kss1 y de regular su fosforilación en condiciones de sobreexpresión, el análisis transcriptómico y los ensayos de fosforilación en mutantes msg5? demuestran que esta fosfatasa no regula negativamente la activi dad de Kss1 ni en condiciones basales ni en las condiciones de activación de Kss1 ensayadas. Mediante el sistema de doble híbrido se ha comprobado que los 125 primeros aminoácidos de Msg5 son esenciales para la interacción con las MAPKs Slt2, Fus3 y Kss1, y que tan sólo los 45 primeros aminoácidos son necesarios para la unión a las dos últimas MAPKs. Se han identificado dos posibles dominios de interacción con MAPKs (dominios docking) en esta pequeña región de 125 aminoácidos del extremo N-termi