Control asistido por magnetismo de ovocitos y embriones a través de nanopartículas unidas a la zona pelúcida

Résumé

El uso de nanopartículas (NP) para aplicaciones biomédicas ha crecido enormemente en las últimas décadas. Entre estos, los desarrollos nanotecnológicos destinados a su aplicación en tecnologías de reproducción asistidas (TRA) se destacaron. A pesar de los importantes avances en este campo, aún no ha sido superada una de las mayores limitaciones de estas tecnologías: la necesidad de manipular los ovocitos y embriones de manera extremadamente delicada y precisa. El objetivo general de esta Tesis Doctoral fue el desarrollo de un novedoso sistema para la manipulación de ovocitos y embriones mediante el uso de NP con capacidad de ser atraídas magnéticamente, utilizando como enlace con la zona pelúcida (ZP) a la proteína oviductina (OVGP1) y el análisis de la seguridad de su aplicación en TRA. En primer lugar, se evaluó la unión de NP superparamagnéticas con la OVGP1 (NPOv) y se analizó la estabilidad de esta unión. La exitosa conjugación fue confirmada, así como su estabilidad por hasta 31 días después de la conjugación. A continuación, se confirmó la capacidad del complejo NPOv de adherirse específicamente a la parte externa de la ZP de ovocitos madurados in vitro y a embriones producidos in vitro en diversos estadios de desarrollo (4 células, mórulas y blastocistos). En un siguiente estudio se evaluó la viabilidad de gametos y embriones en presencia de NPOv. Para ello, se trabajó primero con el biomodelo porcino en condiciones in vitro donde tras la exposición de gametos a NPOv evaluamos su actividad metabólica mediante un analizador de flujo extracelular, los efectos sobre espermatozoides mediante análisis de parámetros de calidad espermática, los efectos sobre la ZP de mediante el estudio del tiempo de digestión por proteasas, los efectos sobre la capacidad fecundante y sobre el desarrollo embrionario mediante un protocolo de Fecundación in vitro (FIV) y Cultivo embrionario in vitro (CE). Los resultados demostraron la ausencia de efectos de las NPOv sobre vialidad de gametos y desarrollo embrionario. Demostrada la ausencia de efectos sobre gametos y embriones porcinos in vitro, continuamos con el análisis de seguridad biológica sobre el biomodelo conejo. Se analizó el efecto de las NPOv unidas a embriones sobre el desarrollo embrionario in vitro, se estudió el efecto de la presencia de embriones con NPOv in vivo en oviducto y útero de coneja tras su transferencia. Adicionalmente se analizó la respuesta del tejido oviductal y uterino a la presencia de embriones con NPOv. Los resultados demostraron que no hubo efectos de la presencia de embriones con NPOv en el desarrollo embrionario tanto in vitro como in vivo, ni sobre la tasa de implantación y la tasa de nacidos vivos, ni su peso al nacimiento. Además, no se observaron efectos de la presencia de embriones con NPOv sobre el tejido oviductal ni uterino. Confirmada la inocuidad de las NPOv, se continuó con la validación de su aplicación para la manipulación de ovocitos y embriones. Primero, evaluamos la capacidad de ovocitos y embriones con NPOv de ser atraídos por un campo magnético. Los resultados demostraron que una tanto ovocitos como embriones fueron atraídos en un porcentaje cercano al 90%. Además, se observó que esta tecnología produce la atracción diferencial de ovocitos maduros por sobre los inmaduros. Seguidamente, analizamos el efecto del campo magnético sobre la viabilidad de ovocitos con NPOv tras someterlos a un protocolo de FIV y CE. Se analizó la viabilidad de embriones obtenidos mediante la secuenciación de su ARN. Adicionalmente, el estado oxidativo fue evaluado en ovocitos- NPOv atraídos y en embriones a mediante el estudio de genes relacionados con estrés oxidativo. Los resultados demostraron que no hubo efectos de las NPOv ni del campo magnético sobre los paramaros analizados (tasa de desarrollo embrionario, transcriptoma de los embriones obtenidos, genes relacionados a estrés oxidativo y la intensidad de ROS en ovocitos). En resumen, esta tesis doctoral ha desarrollado y validado una herramienta robusta e inocua, basada en la funcionalización de NP magnéticas con una proteína recombinante que actúa de nexo especifico con la ZP de ovocitos y embriones. Este trabajo ha demostrado que el sistema puede ser utilizado de manera segura para la manipulación ovocitos y embriones mediante campos magnéticos, permitiendo su direccionamiento y/o posicionamiento. Esta novedosa herramienta tiene un gran potencial en las TRA, para su aplicación en diferentes especies