Identification of new risk factors involved in the progression of Philadelphia Negative Chronic Myeloproliferative Neoplasms

Resumen

Introducción: Las neoplasias mieloproliferativas son hemopatías caracterizadas por la expansión clonal de líneas celulares mieloides en la médula ósea (MO), lo que conduce a una producción excesiva de células sanguíneas. Se clasifican en policitemia vera (PV), trombocitemia esencial (TE) y mielofibrosis (MF). Estas tres constituyen las neoplasias mieloproliferativas clásicas Filadelfia negativas (NMP), ya que carecen del gen de fusión BCR::ABL1, que se observa en la leucemia mieloide crónica (LMC). Los pacientes con NMP comparten características clínicas como esplenomegalia, síntomas constitucionales y mayor riesgo de eventos trombóticos. La mediana de supervivencia varía entre los subtipos, siendo la MF la de menor supervivencia. Las mutaciones en JAK2, CALR y MPL son factores clave en la NMP y activan la vía de señalización JAK/STAT. La inflamación desempeña un papel crucial en el desarrollo y la progresión de la NMP, contribuyendo a los síntomas, la fibrosis y la progresión de la enfermedad. La inflamación crónica también puede provocar complicaciones cardiovasculares y aumentar la susceptibilidad a otras neoplasias. MiR-146a se ha identificado como regulador de la vía inflamatoria NF-κB, cuya desregulación está relacionada con diversas enfermedades inflamatorias. Los ratones carentes de miR-146a (KO) desarrollan un fenotipo mieloproliferativo y fibrótico similar a la MF, lo que ofrece un modelo para estudiar los mecanismos inflamatorios en ausencia de mutaciones conductoras. Comprender la relación entre la inflamación y los procesos malignos es crucial para desarrollar tratamientos eficaces para los pacientes con NMP. Objetivos: Investigar el papel de la inflamación, específicamente la vía NF-κB, en la progresión de la NMP. Los tres objetivos específicos incluyen estudiar el impacto de miR-SNPs de MIR146A en la susceptibilidad y progresión a estadios avanzados de la NMP, determinar si la inhibición de la señalización NF-κB y/o JAK/STAT puede revertir el fenotipo tipo MF en ratones KO envejecidos, y evaluar si la inhibición de JAK2/IRAK1 puede prevenir el desarrollo del fenotipo tipo MF en ratones KO más jóvenes. Material y métodos: Para ello, se examinó la relación entre ambas vías NF-κB y JAK/STAT en pacientes con NMP, así como en el modelo murino miR-146a-KO y en un modelo celular. Se recogió ADN de pacientes y controles para la determinación del genotipo y se analizaron las citoquinas plasmáticas. Los ratones KO de edad avanzada, que presentaban el fenotipo, fueron tratados con ruxolitinib (inhibidor JAK1/2), BMS-345541 (inhibidor IKKα/β), ambos inhibidores en combinación, o pacritinib (inhibidor JAK2/IRAK1) para revertir el fenotipo, mientras que los ratones más jóvenes, sin desarrollar el fenotipo, fueron tratados con pacritinib para prevenir o retrasarlo. Se realizó un hemograma completo, cuantificación de citoquinas plasmáticas, estudio del bazo (macroscópico, citometría de flujo, análisis histológico y análisis de proteínas por western blot) y estudio histológico de la MO de fémures. Como modelo de hematopoyesis clonal se empleó la línea celular humana SET2 (JAK2V617F). Se incubaron con los mismos tratamientos descritos anteriormente, y se analizó la expresión proteica mediante western blot. Además, estas células se cocultivaron con una línea estromal (HS-27A) con los fármacos. La expresión génica y proteica del colágeno (COL1A1) de HS-27A se analizó mediante RT-qPCR e inmunofluorescencia, respectivamente. Resultados: El genotipo rs2431697-TT se asoció con MF, especialmente con la MF post-PV/TE. Los pacientes con este genotipo presentaron una menor tasa de supervivencia libre de MF, eran más propensos a evolucionar a MF secundaria y mostraron niveles elevados de citoquinas inflamatorias. Además, los ratones miR-146a-KO mostraron un aumento de la señalización STAT3 con el envejecimiento. Aunque todos los tratamientos provocaron una reducción del tamaño del bazo y una restauración parcial de su arquitectura, sólo la inhibición de NF-κB condujo a una reducción de la hematopoyesis extramedular, la fibrosis de la MO y la osteoesclerosis, junto con una atenuación del estado inflamatorio exacerbado. Sin embargo, la terapia combinada empeoró la anemia al inducir hipoplasia de la MO. La terapia combinada y pacritinib redujeron la señalización NF-κB y JAK/STAT en células SET-2 mutadas con JAK2. Además, el tratamiento combinado redujo la producción de COL1A1 en el cocultivo SET-2+HS-27A. Pacritinib previno la esplenomegalia, la fibrosis de la reticulina de la médula ósea y la osteoesclerosis observadas en ratones KO sin tratar. También evitó la mieloproliferación, la pérdida de arquitectura esplénica y la hematopoyesis extramedular. Además, se observó que pacritinib atenuaba el entorno proinflamatorio, evitando el aumento de citoquinas inflamatorias (CXCL1 y TNFα) sin inducir citopenias, sino más bien lo contrario. Los ratones tratados con pacritinib mostraron recuentos plaquetarios más elevados, mientras que los recuentos eritrocitarios fueron mayores en los ratones tratados a largo plazo. Por último, pacritinib redujo la producción de COL1A1 en el modelo de cocultivo. Conclusiones: Este proyecto pone de manifiesto la importancia de la inflamación en el desarrollo y progresión de la NMP, en particular de la MF, como potencial diana terapéutica. El genotipo rs2431697-TT, asociado a niveles más bajos de miR-146a, se erige como un nuevo factor pronóstico de la progresión de la MF. En ratones envejecidos con características similares a la MF, la inhibición de NF-κB sola o en combinación con JAK/STAT reduce la inflamación, la esplenomegalia y revierte la trombocitopenia y la fibrosis de la MO. Los estudios con líneas celulares humanas mutadas en JAK2 mostraron una reducción de la expresión de COL1A1. Todo ello respalda su potencial terapéutico en las enfermedades inflamatorias. La inhibición dual temprana de JAK/STAT y NF-κB en ratones KO jóvenes previene los síntomas similares a la MF, también apoyada por los resultados en líneas celulares, enfatizando los beneficios de la intervención temprana en el manejo de la enfermedad.