Actividades monofenolasa y difenolasa de tirosinasamecanismo, catálisis, inhibición e inactivación

Resumen

La enzima tirosinasa o polifenol oxidasa (EC 1.14.18.1) es una cupoproteína, muy extendida en la naturaleza, desde hongos, bacterias, plantas y animales. Cataliza dos reacciones consecutivas, la hidroxilación de monofenoles a o-difenoles y la oxidación de estos últimos a o-quinonas utilizando oxígeno molecular. 1. OBJETIVOS El objetivo principal de esta tesis es profundizar en la catálisis de tirosinasa en su actividad monofenolasa. Al mismo tiempo, se discute una metodología para el estudio de inhibidores sobre la actividad difenolasa de la enzima. Como objetivos específicos se destacan: - Discutir la clasificación de los principales despigmentantes descritos en la bibliografía. - Analizar los métodos espectrofotométricos que utilizan como nucleófilo acoplado MBTH (3-Metil-2-benzotiazolona hidrazona) para medir la formación de producto en la actividad monofenolasa, respecto a los métodos espectrofluorimétricos que miden la desaparición de L-tirosina en presencia de borato. - Profundizar en el estudio de la actividad monofenolasa, para ello se han elegido cuatro tipos de sustratos (A, tipo L-tirosina; B, tipo hidroquinona; C, tipo 4-terc-butilfenol y D, tipo desoxiarbutina). - Analizar el docking de estos compuestos (monofenoles) a las formas metatirosinasa y oxitirosinasa. - Desarrollar una expresión analítica para el grado de inhibición en la actividad difenolasa de tirosinasa que posibilite la determinación de IC50. - Confirmar que los estudios de docking ayudan a discernir si una molécula puede ser sustrato de la enzima. - Estudiar moleculas que son sustratos de la enzima y discutir si el docking confirma este comportamiento. Aplicación al 4-bromofenol y 4-(4-hidroxifenil)-2-butanona. 2. METODOLOGIA Para avanzar en este estudio se han utilizado técnicas espectrofotométricas ultravioleta/visible, técnicas de resonancia magnética nuclear para determinar espectros de 13C-RMN, técnicas de simulación para poder comprobar las predicciones del comportamiento teórico de la enzima y también técnicas de docking para poder predecir las interacciones de las distintas especies enzimáticas con los distintos ligandos. 3. CONCLUSIONES Se ha profundizado en el estudio de la actividad monofenolasa de tirosinasa, tanto en los aspectos cinéticos y estructurales como en los aplicados. También se ha abordado el estudio de la inhibición de la actividad difenolasa, proponiendo una metodología para la caracterización de inhibidores. Como conclusiones específicas se destacan: - Se propone que se saquen de la lista de despigmentantes al 4-n-butilresorcinol, alfa-arbutina y ß-arbutina, porque se demostró que son sustratos de tirosinasa en presencia de peróxido de hidrogeno o de L-dopa. - Las medidas espectrofluorimétricas son más sensibles que las espectrofotométricas, en el caso de las espectrofluorimétricas se propuso seguir la desaparición de sustrato, L-tirosina, pero se produce una falta de respuesta lineal al aumentar la concentración de ésta. - Los monofenoles los agrupamos en: Tipo A, son aquellos en los que la evolución de la o-quinona origina la acumulación de o-difenol en el medio de reacción. Tipo B, son aquellos monofenoles para los que la evolución de la o-quinona no permite la acumulación de o-difenol en el medio, porque se oxida por el oxígeno de la disolución. Tipo C, son los monofenoles que originan o-quinonas muy estables y, por lo tanto, no evolucionan acumulando o-difenol en el medio. Tipo D, son aquellos que no liberan o-difenol al medio y cuya o-quinona es muy estable. - Se ha desarrollado la expresión analítica del parámetro IC50 en función de las constantes aparentes de inhibición y para cada mecanismo de inhibición, en el caso de la enzima tirosinasa. Del mismo modo se propone un diseño experimental y análisis de datos en base al grado de inhibición. - A partir de los estudios de docking de distintas moléculas a la forma oxitirosinasa, se confirma para las moléculas indicadas (4-bromofenol y 4-(4-hidroxifenil)-2-butanona) la utilidad del docking en la predicción de sustratos de la enzima.