Caracterización molecular, funcional y clínica de la deficiencia congénita de antitrombinamejoras en el diagnóstico y en la comprensión de su fisiopatología

Resumen

La antitrombina es una N-glicoproteína clave en el sistema hemostático por su actividad anticoagulante, función que amplifica la heparina. La antitrombina está codificada por el gen SERPINC1. Variantes genéticas en SERPINC1 son responsables de más del 75% de los casos con deficiencia de antitrombina, desorden dominante que constituye la principal y más grave trombofilia hereditaria. El correcto diagnóstico de la deficiencia de antitrombina es importante no solo para conocer la base molecular de la trombosis y facilitar un cribado familiar, sino porque también ayuda en el manejo clínico del paciente, incluyendo la duración y tipo de tratamiento anticoagulante. Aunque es un desorden conocido desde hacer casi 60 años, quedan retos por resolver en la deficiencia de antitrombina. Así, este desorden podría estar subestimado, por las limitaciones de los métodos diagnósticos disponibles, mayoritariamente funcionales. Por otra parte, la base molecular de la heterogeneidad clínica en los pacientes con deficiencia de antitrombina es poco conocida. OBJETIVOS 1. Comparar diferentes métodos de diagnóstico molecular de la deficiencia de antitrombina, mostrando sus debilidades y fortalezas. 2. Definir el efecto funcional y clínico de variantes en SERPINC1 que afectan a residuos arginina potencialmente implicados en la interacción con la heparina. 3. Identificar variantes naturales en SERPINC1 que generen nuevas secuencias de N-glicosilación, y caracterizar sus consecuencias funcionales e impacto clínico. 4. Caracterización del efecto funcional y patológico de nuevas mutaciones en SERPINC1 identificadas mediante secuenciación no dirigida en cohortes de pacientes con trombosis. METODOLOGÍA - Analizamos la antitrombina del plasma y el gen SERPINC1 en 663 pacientes, 588 pacientes con sospecha de deficiencia de antitrombina y 75 pacientes COVID en los que se secuenció el exoma completo. - Identificamos variantes de SERPINC1 en base de datos (HGMD®, GnomAD y en manuscritos publicados), que fueron analizadas evaluando la secreción, glicosilación y función de la antitrombina variante generada mediante mutagénesis dirigida y expresadas en células HEK-EBNA. Tanto las antitrombinas plasmáticas como las recombinantes se analizaron mediante Western blot, digestión con PNGasa F, ensayos funcionales con diferentes proteasas, ensayos cromogénicos, inmunoelectroforesis cruzada, y ELISA. El estudio molecular de SERPINC1 se realizó mediante MLPA, secuenciación de Sanger y nanoporo. RESULTADOS /CONCLUSIONES - Las variantes estructurales suponen entre el 5 y el 8% de casos con deficiencia de antitrombina. La combinación de una mutación puntual y una variante estructural, si existe, es muy rara en la deficiencia de antitrombina. - La identificación de falsos positivos por MLPA aconsejan un diseño cuidadoso de las sondas que evite regiones con polimorfismos y la validación de todo resultado positivo. - Las mutaciones de residuos arginina en la antitrombina tienen consecuencias heterogéneas, tanto bioquímica como clínicamente. - Identificamos la tercera heterocigosis compuesta de variantes que afectan la afinidad por heparina, con muy alto riesgo trombótico. - La generación de nuevas secuencias de N-glicosilación en SERPINC1 resultado de mutaciones naturales tienen considerable heterogeneidad atendiendo tanto a su ocupación como a las consecuencias funcionales (defectos de secreción o de afinidad por heparina) y las implicaciones clínicas (generando deficiencias moderadas o graves). - La eficacia de glicosilación podría modularse modificando la disponibilidad de glucosa. - Existe un elevado número de variantes de SERPINC1 identificadas mediante secuenciación del gen en pacientes con trombosis que no se detectan fácilmente con los métodos funcionales comerciales. - Nuestros resultados recomiendan el desarrollo de un sistema de evaluación de deficiencia de antitrombina basado en la inhibición del FVIIa.