Análisis del microbioma-metiloma y estudio de asociación entre Fusobacterium nucleatum y marcadores moleculares en el cáncer colorrectal

Resumen

Objetivo: Estudio del microbioma y metiloma a partir de muestras de tejido intestinal de pacientes con CCR para establecer asociaciones entre el perfil de metilación genética a nivel de islas CpG y la abundancia relativa respecto al género Fusobacterium. A su vez, se lleva a cabo el estudio de asociación entre la cuantificación relativa de Fusobacterium nucletarum y las características clínicas y moleculares en el CCR, así como la utilidad potencial de la medición del nivel de F. nucletaum en el diagnóstico/cribado del CCR. Material y métodos: Se incluyen un total de 154 muestras emparejadas correspondientes a 77 pacientes con CCR, tanto de tejido tumoral (T) como de tejido no tumoral periférico (NT), clasificadas según tipo de CCR (CC, SAC y hmMSI), localización (proximal, distal) y estadio según criterios TNM. El estudio del microbioma bacteriano en muestras T y NT se realiza mediante tecnología NGS (IlluminaMiSeq System®). El estudio del perfil de metilación del ADN a nivel de islas CpG en muestras T se realiza mediante el array Infinium® HumanMethylation450 BeadChip y los resultados se validan por pirosecuenciación. El estado MSI se determina mediante el kit MSI Analysis System (Promega) y el estado CIMP con la técnica SALSA® MS-MLPA® Probemix ME042-C1 CIMP (MRC-Holanda). También se determinan mediante pirosecuenciación las mutaciones de los genes: KRAS, BRAF y PIK3CA. Finalmente se realiza la cuantificación bacteriana global y de F. nucletaum por qPCR. Las diferencias existentes entre muestras T y NT en cuanto a microbioma se han estudiado mediante el método PCA (Principal Component Analysis), la prueba U de Mann-Withey-Wilcoxon y el análisis LDA (“linear discrimination analysis”). El análisis de correlación de Pearson entre la abundancia relativa del género Fusobacterium y el nivel de metilación de los genes estudiados se ha realizado con la función R statscor utilizando RStudio IDE versión 1.0.143. Para el resto de análisis estadísticos, tanto del estudio de validación del porcentaje de metilación, del análisis de correlación entre la cuantificación relativa de F. nucletaum y los porcentajes de metilación, o de asociación con los distintos marcadores de interés, se ha utilizado el paquete estadístico SPSS versión 21.0. Resultados: El análisis de la diversidad de géneros bacterianos realizado entre muestras T y NT según la localización determina que existen diferencias significativas que especificamente son debidas a muestras T de localización distal, con una menor diversidad, mientras que no existen diferencias de diversidad microbiana según el tipo de CCR. El PCA de los datos de microbioma no muestra diferencias entre los casos. Entre los géneros bacterianos con diferencias significativas en su abundancia relativa entre muestras T y NT se encuentran Bacteroides, Eubacterium, Fusobacterium y Acinetobacter, que se presentan como los géneros con mayor poder discriminatorio en el modelo predictivo obtenido mediante el método LDA a favor de muestras T, mientras que únicamente el género Lachnoclostridium se presenta como género en el modelo predictivo a favor de muestras NT. El estudio de validación realizado a partir de los datos obtenidos por el análisis de correlación para el nivel de metilación genético y la abundancia relativa del género Fusobacterium ha confirmado una correlación positiva con la metilación de los genes PLCH1, mirLET7D, EGFR y COBL. En cambio el nivel de F. nucletaum ha mostrado correlación positiva únicamente con el gen ZNF788. No se encuentran diferencias en la cuantificación de F. nucletaum en cuanto a sexo y localización. Existen diferencias significativas entre CC y SAC/hmMSI que se dan a nivel proximal, y entre los tumores de mayor tamaño (T3, T4) o estadios avanzados (II, III, IV) frente a los de menor tamaño (Tis, T1, T2) o estadio (0, I). También existen diferencias significativas entre MSS y MSI-H, entre CIMP-H y CIMP-L, y para los estados mutados de los genes KRAS y BRAF, mientras que no se encuentran para PIK3CA. El análisis multivariante confirma que el estado MSI, estadio CCR y el tipo de CCR son las variables que presentan asociación significativa de forma independiente con la cuantificación relativa de F. nucletaum. La cuantificación relativa de F. nucletaum presenta una eficiencia diagnóstica para CCR del 69%. Se establece el punto de corte óptimo en una diferencia ≤ 10 ciclos en Ct de F. nucletaum y Ct de carga bacteriana total obtenidos por qPCR. El modelo predictivo establece que la cuantificación relativa de F. nucletaum es predictor independiente de CCR (OR=2,23; IC95% [1,51-3,30]) y del tipo de CCR SAC/hm-MSI frente a CC (OR=2,00; IC95% [1,22–3,28]). Conclusiones: Se han encontrado potenciales biomarcadores potenciales bacterianos para CCR (géneros Bacteroides, Eubacterium, Fusobacterium y Acinetobacter). Además los genes PLCH1, mirLET7D, EGFR y COBL han mostrado un estado hipermetilado asociado a la abundancia del género Fusobacterium spp. en muestras T, mientras que sólo el porcentaje de metilación del gen ZNF788 ha mostrado correlación positiva con la cuantificación relativa de F. nucletaum. El nivel de F. nucletaum se asocia de forma significativa al tipo de CCR SAC/hmMSI, estadios avanzados, estado MSI-H, estado CIMP-H y BRAF mutado, aunque el análisis multivariante confirma la asociación de forma independiente con el CCR tipo SAC/hmMSI, estadios avanzados y estado MSI-H. Debido a la buena especificidad obtenida para la cuantificación relativa de F. nucletaum se propone dicho parámetro como candidato a la mejora del cribado/diagnóstico del CCR mediante técnicas no invasivas, incluso llegando a poder diferenciar entre CC y SAC/hmMSI.