Desarrollo de metodología de cribado y optimización de extracción de fluidos corporales a partir de polímeros superabsorbentes (SAP) en casos de agresión sexual

Resumen

La Tesis Doctoral intitulada Development of methods of screening and extraction of bodily fluids in superabsorbent materials prior to genetic profiling in sexual aggression cases tuvo como objetivo desarrollar un método espectral no-invasivo de detección y diferenciación de diferentes fluidos biológicos impregnados en materiales superabsorbentes, de modo a aumentar la eficiencia del cribado para una detección confirmatoria. Además, se pretendió optimizar la extracción de fluidos biológicos de los materiales superabsorbentes, en particular semen, para el posterior análisis del perfil genético en muestras de agresiones sexuales. En primer lugar, se recopilaron datos bibliográficos para lograr una descripción de los métodos actuales de identificación y extracción de los fluidos biológicos, identificando las varias dificultades de esos métodos analíticos. Las muestras de materiales higiénicos superabsorbentes en los casos de agresiones sexuales representan un reto para los laboratorios forenses. Estos materiales sanitarios tienen varias capas de diferente composición y capacidad de absorción. Por su composición, los materiales higiénicos superabsorbentes retienen fluidos biológicos, y se usan en el contexto forense para recuperar ADN del agresor para obtener un perfil genético. Sin embargo, su complejidad representa un problema para la identificación y extracción de fluidos biológicos en los laboratorios forenses. En la Sección 1, un método fue desarrollado y descrito para el un cribado no-invasivo de fluidos biológicos. En este estudio, se han analizado de manera no-destructiva por Espectroscopia Infrarroja con Transformada de Fourier y Reflectancia Total Atenuada (ATR-FTIR) manchas de semen, fluido vaginal y orina impregnados en materiales higiénicos superabsorbentes, como compresas y pañales. Aunque las capas inferiores tienen la mayor capacidad de absorción, se han podido detectar los tres fluidos biológicos al analizar la capa superior de los materiales higiénicos superabsorbentes por ATR-FTIR. Esto demuestra que los fluidos biológicos se distribuirán entre todas las capas. Además, se han analizado también mezclas de los tres fluidos biológicos impregnadas en materiales higiénicos superabsprbentes y en sustratos de algodón, visto que en las investigaciones forenses de agresiones sexuales las evidencias analizadas suelen contener mezclas de diferentes fluidos. Semen y fluido vaginal se han diferenciado de orina, por la firma espectral específica de sus proteínas (región espectral de 1800 - 1480 cm-1). Sin embargo, el fluido vaginal tiene una firma espectral muy similar al semen, debido a la composición proteica muy similar de estos fluidos. Para discriminar los fluidos biológicos sin dañar la muestra, las firmas espectrales de los fluidos obtenidos de mezclas en materiales superabsorbentes y algodón, se compararon con las firmas espectrales de muestras individuales de cada fluido aplicando un método de análisis estadístico. Definiendo diferentes umbrales, este método podrá ser aplicado para un cribado inicial para identificar las muestras que contienen semen; y, de seguida, podrá ser aplicada para una discriminación más exacta de las manchas con mayor contenido de semen. Así, el técnico forense conseguiría seleccionar las mejores muestras para proceder con la posterior extracción de ADN para intentar lograr el perfil genético del agresor. El método descrito permite obtener resultados cualitativos y fidedignos, sin interpretación humana. Como tal, el método propuesto tendría la posibilidad de ser un sistema eficiente, automatizado y barato para el cribado no-destructivo de semen, que podría ser fácilmente implementado en los laboratorios forenses. Por otro lado, se estudió la extracción de fluidos biológicos, en particular semen, de materiales higiénicos superabsorbentes. El procedimiento actual para extracción de semen de los materiales superabsorbentes consiste en la incubación de las capas superiores, libres de SAPs, con agua. En la Sección 2, se desarrolló un protocolo de extracción de fluidos considerando todas las capas de los materiales higiénicos superabsorbentes, incluyendo la capa inferior absorbente. No existían estudios describiendo la eficiencia de recuperación de semen de las diferentes capas y una evaluación cuantitativa era necesaria. Por lo que, la subsección 2.1 fue el primer estudio publicado caracterizando diferentes materiales higiénicos superabsorbentes y evaluando la eficiencia de recuperación de semen de las capas superiores libres de SAPs. Se ha detectado semen hasta la dilución 1:25000 en las capas superiores de todos los sustratos estudiados, obteniendo una recuperación máxima de 8% para ADN masculino y de 4% para células espermáticas. Además, se han simulado las capas inferiores absorbentes, preparando hidrogeles de poliacrilato de sodio impregnados con semen. La aplicación de diferentes tratamientos químicos seguidos de la filtración con membranas de nylon y poliéster (PETE) instaladas en tubos NAO® Baskets han permitido la extracción de semen desde los hidrogeles. La incubación con isopropanol 100% presentó la mayor recuperación de células espermáticas (6,0%). Los resultados anteriores han demostrado la necesidad de desarrollar y optimizar el protocolo de extracción de semen de las capas inferiores, en contraste con el procedimiento actual que solo considera las capas superiores. Por lo que se realizó un estudio para analizar la eficiencia de diferentes tratamientos químicos y físicos para extraer semen de las capas inferiores de los materiales higiénicos superabsorbentes. La composición de la capa inferior consiste en sales de poliacrilato de sodio (SAPs). Los SAPs retienen fluidos biológicos y se transforman en un hidrogel, bloqueando la posibilidad de obtener células y por lo tanto de obtener el material genético. Los tratamientos químicos y físicos se han comparado para maximizar la recuperación de semen y ADN masculino de materiales superabsorbentes, como compresas y pañales. Fue posible obtener perfiles genéticos, sin interferencia química o de los SAPs, de soluciones extraídas con diferentes tratamientos de la capa inferior de los materiales higiénicos superabsorbentes. Además, se han obtenido mejores recuperaciones de semen y ADN masculino cuando extraídos de todas las capas de los materiales superabsorbentes, en comparación con la recuperación de las capas superiores. De acuerdo con los resultados de la presente Tesis, se recomienda inducir la desidratación de los hidrogeles, de manera a maximizar la extracción de fluidos biológicos. Este tipo de evidencias puede tener un impacto crucial en los casos de agresiones sexuales, por su capacidad de retener fluidos biológicos y por mantener la integridad del ADN. Sin embargo, hay un número muy reducido de estudios publicados enfocados en la optimización de la extracción de los fluidos biológicos de los materiales higiénicos superabsorbentes.