Caracterización in vitro de células madre/estromales mesenquimales adiposas caninas modificadas mediante exofucosilación enzimática

Resumen

Las células madre/estromales mesenquimales (MSC) son una población de células indiferenciadas con capacidad de autorrenovación y diferenciación a células de distintos linajes mesodérmicos. Su identificación y utilización terapéutica está generando grandes expectativas tanto en medicina humana como veterinaria gracias a su capacidad para secretar moléculas antinflamatorias e inmunomoduladoras, así como otras señales bioquímicas que estimulan la regeneración celular y reparación de los tejidos dañados. En estudios previos se ha comprobado que estos efectos tróficos beneficiosos se encuentran estrechamente relacionados con su capacidad de migración y extravasación hacia los tejidos inflamados. En estos tejidos, se expresan altos niveles de E-selectina, cuya expresión está regulada por citoquinas proinflamatorias como la IL-1 o el TFN-α. Sin embargo, las MSC carecen de la expresión de ligandos para E-selectina como CLA (glicoforma sialofucosilada de PSGL-1) o HCELL (glicoforma sialofucosilada del receptor CD44), lo cual limita su capacidad de migración a los tejidos dañados y afectando por tanto a su eficacia terapéutica tras su administración intravenosa. No obstante, se están desarrollando distintas estrategias para mejorar la capacidad de migración in vivo de las MSC hacia estos tejidos, siendo una de ellas la glicoingeniería de la superficie celular donde destaca la exofucosilación enzimática. Esta técnica consiste en la modificación transitoria del receptor CD44 presente en las MSC, que por medio de un proceso enzimático es transformado en la molécula HCELL que es el ligando más potente de E-Selectina. El objetivo principal de este estudio consistió en determinar si era posible fucosilar de forma efectiva las MSC derivadas del tejido adiposo (AT-MSC) caninas, y si este proceso de exofucosilación enzimática provoca alguna alteración en sus propiedades y/o características celulares y funcionales, evaluando además su preservación en condiciones de refrigeración con vistas a un posible uso terapéutico en la práctica clínica veterinaria. MATERIALES Y MÉTODOS: Las AT-MSC fueron aisladas a partir de lipoexplantes de grasa procedentes de perros donantes (n=10). Para ello, una vez en el laboratorio los lipoexplantes fueron sometidos a una digestión mecánico-enzimática, obteniéndose el cultivo primario y los siguientes subcultivos hasta llegar a pase 2-4, momento en el que fueron sometidas a la exofucosilación enzimática para la realización de los experimentos planificados: 1) Verificación del proceso de exofucosilación enzimática de las AT-MSC caninas; 2) Determinación de la estabilidad de la exofucosilación enzimática en las AT-MSC FUC en condiciones de cultivo (37ºC) y en refrigeración RESUMEN - 267 - (4ºC); 3) Caracterización celular de las AT-MSC FUC en función de su morfología celular, inmunofenotipo y capacidad de diferenciación multipotencial hacia células del tejido adiposo, óseo y cartilaginoso; 4) Caracterización funcional de las AT-MSC FUC determinando su capacidad de proliferación, de migración, de secreción y de inmunomodulación celular; y 5) Estudio de la viabilidad celular en condiciones de refrigeración (4ºC) de las AT-MSC caninas tras su fucosilación. Los datos fueron recopilados en una base de datos Excel© v.19 y analizados mediante el software GraphPadPrism© v.8. RESULTADOS: Nuestros resultados mostraron que las AT-MSC caninas pueden ser fucosiladas de forma efectiva (>98%), revirtiéndose este proceso en condiciones de cultivo celular en menos de 72h en condiciones de cultivo celular (6%) pero manteniéndose estable y funcionales en condiciones de refrigeración (4ºC) durante al menos 4 días (>90%). Además, observamos que las AT-MSC FUC mantienen sus características celulares conservando su morfología, inmunofenotipo celular, capacidad de diferenciación multipotencial hacia tejido adiposo, óseo y cartilaginoso, y capacidad de proliferación. Sin embargo, encontramos que la exofucosilación enzimática aumenta 1,7 veces más su capacidad de migración, y que se vuelven más antinflamatorias e inmunomoduladoras, potenciándose estos efectos aún más en presencia de citoquinas proinflamatorias (TNF-α + IFNγ) como las que se expresan en los tejidos inflamados o dañados. Por último, también observamos que la exofucosilación enzimática no afecta de forma significativa a la viabilidad celular de las AT-MSC caninas, pudiendo además mantenerse funcionales mediante refrigeración a 4ºC durante al menos 4 días.y con una viabilidad celular superior al 90%. CONCLUSIONES: A la vista de los resultados obtenidos, podemos concluir que la exofucosilación enzimática es una técnica factible y segura para su aplicación en AT-MSC caninas, ya que no afecta de forma significativa a las características celulares propias de estas células mesenquimales, y que de forma importante potencia su capacidad de migración y sus efectos terapéuticos antinflamatorios e inmunomoduladores, pudiendo emplearse esta modificación celular para optimizar y mejorar las propiedades de las AT-MSC caninas. De este modo en un futuro próximo esta técnica podría ser utilizada en la práctica clínica veterinaria para el tratamiento de diversas patologías de base inflamatoria y/o inmunomediadas