Deciphering the molecular and cellular dynamics of early phagocytosis and granuloma formation in response to Mucorales

Resumen

Las infecciones fúngicas han aumentado en las últimas décadas, principalmente debido al incremento de la población de individuos inmunocomprometidos, lo que se atribuye al uso de tratamientos inmunosupresores y a la prevalencia de enfermedades crónicas como el VIH. El uso de estos tratamientos debilita su sistema inmunológico, haciendo que estos pacientes sean más susceptibles a infecciones por hongos patógenos oportunistas, como el grupo de los Mucorales. Los miembros de este grupo de hongos, clasificados por la Organización Mundial de la Salud como un grupo de alta prioridad, causan una infección potencialmente mortal conocida como mucormicosis, que se caracteriza por altas tasas de mortalidad y tratamientos antifúngicos limitados. En esta tesis, utilizando como organismos modelo Mucor lusitanicus y Rhizopus microsporus, que son dos agentes causales de la mucormicosis, se han descrito los eventos moleculares que operan en la fagocitosis temprana de las esporas de estos hongos y en los granulomas incipientes que se forman cuando el patógeno evade el primer mecanismo de defensa (fagocitosis) y germina formando micelio. Además, se llevó a cabo el estudio de la regulación génica mediada por RNA de interferencia y la predicción de los RNA largos no codificantes (lncRNAs) de estos dos Mucorales y su participación en la interacción patógeno-hospedador. Para caracterizar los granulomas incipientes que se forman en respuesta a esporas germinadas, se desarrolló un protocolo para aislar estos agregados celulares en un modelo de ratón después de 3 horas de infección. La integración de la caracterización molecular de los agregados celulares mediante análisis transcriptómico con su descripción celular mediante análisis de microscopía electrónica y óptica permitió establecer que los neutrófilos son los principales componentes de los granulomas incipientes. Por otro lado, se describieron las redes de genes fúngicos que se activan en las interacciones patógeno-hospedador, ya sea en la fagocitosis de las esporas por los macrófagos o en los granulomas incipientes, determinando que los factores de transcripción BRCA1 y HMG-BOX, las proteínas relacionadas con la cromatina; Histona 1 y Desacetilasa de histonas 1 (HDA1), y una glutamato sintasa son necesarias para la virulencia total de R. microsporus. Curiosamente, BRCA1 y la Histona1 también parecen participar en la virulencia de M. lusitanicus, constituyendo factores de virulencia comunes a ambos Mucorales. Además, se evaluó la regulación génica mediada por el mecanismo de degradación de ARN de interferencia que está implicado en virulencia y que se conoce como Non-Canonical RNA Interference Pathway (NCRIP), porque utiliza la ribonucleasa III atípica R3B2 en M. lusitanicus. La secuenciación simultánea de ARN pequeños y ARN mensajeros de las estirpes silvestre y mutante en r3b2 en condiciones saprofitas y durante su interacción con macrófagos, y el análisis de su perfil transcriptómico permitió identificar las dianas directas del NCRIP. La mayoría de los genes diana identificados son transposones. Entre las dianas directas se incluyen transposones tipo LTR, que se han descrito por primera vez en el genoma de M. lusitanicus en este trabajo. Interesantemente, utilizando dos marcadores del NCRIP, se generaron cepas bioluminiscentes que contienen la fusión de estos marcadores con el gen de la luciferasa para poder estudiar, de forma rápida y sencilla, la regulación del NCRIP. Para tener una comprensión más completa de la regulación génica en el patógeno durante su fagocitosis y durante la formación del granuloma incipiente, se describieron los lncRNAs de R. microsporus y M. lusitanicus. Este análisis permitió identificar cientos de lncRNAs intergénicos, algunos se expresan de forma la interacción patógeno-hospedador. La disrupción de cuatro lncRNA implicados en la infección in vivo de ratones por R. permitió el descubrimiento de dos lncRNA esenciales para la supervivencia del patógeno: lncRNA2 y lncRNA4. Finalmente, tanto los genes codificantes de proteínas descritos como factores de virulencia, como los lncRNAs 2 y 4 constituyen nuevas dianas para el diseño de nuevos tratamientos antifúngicos que bloqueen el crecimiento y la diseminación de hongos y son buenos candidatos como marcadores moleculares de la infección por mucormicosis.