Factores de origen femenino y masculino relacionados con la fertilidad humana y su aplicación en clínicas de reproducción asistidaproteínas del fluido folicular y genes de compactación del ADN espermático

Resumen

La infertilidad afecta alrededor del 15% de parejas en edad reproductiva. Su prevalencia se considera similar entre países desarrollados y países en vías de desarrollo; no obstante, está en aumento a nivel mundial por diversos factores clínicos y de hábitos sociales como la obesidad, enfermedades de transmisión sexual, e incluso por postergar la edad para concebir. La infertilidad se ha abordado considerando su origen como femenino o masculino, aunque existe un porcentaje importante de casos definidos como idiopáticos, por lo que existe un interés creciente en el diagnóstico adecuado de la pareja infértil. Dentro del manejo de la infertilidad femenina, muchas mujeres requieren tratamientos de fecundación in vitro (FIV) para lograr un embarazo a término con un niño/a nacido vivo. En una FIV, la recuperación de complejos cúmulus-ovocito (COCs) competentes es importante. Considerando que en esta competencia influye de manera decisiva la contribución de las células del cúmulus y el fluido folicular (FF), el estudio de la composición de este biofluido y su relación con la infertilidad es relevante. De hecho, la oscilación de las concentraciones de proteínas totales del FF podría afectar a la competencia del ovocito; así mismo, los niveles de especies reactivas de nitrógeno (RNS) permitirían evaluar el daño oxidativo de las proteínas presentes en el fluido folicular humano (FFH). Por otro lado, en la infertilidad masculina, entre el 30 y 72% de los casos aún son diagnosticados como idiopáticos, por lo que se han desarrollado pruebas diagnósticas más completas que permiten evaluar factores moleculares y genéticos como posibles causas de la infertilidad. Sin embargo, estas pruebas no son de uso rutinario en la práctica clínica. Entre las causas genéticas estudiadas en relación con la fertilidad masculina se encuentran los polimorfismos en los genes involucrados en la compactación del ADN: PRM1, PRM2, TNP1 y TNP2. También, la expresión de estos genes (ARN) y el estado de protaminación del ADN son de interés en el estudio de la infertilidad masculina. Considerando lo expuesto, y tras una exhaustiva revisión bibliográfica expuesta en el capítulo I, este trabajo pretende abordar el estudio de la infertilidad desde su vertiente femenina y masculina para identificar biomarcadores sencillos y no invasivos que puedan ser utilizados como predictivos del éxito de los tratamientos de fertilidad en la clínica rutinaria y, de este modo, mejorar la eficiencia en los ciclos de reproducción asistida. En el capítulo II se estudió en el FFH, la concentración de proteínas totales (PT), albúmina y globulinas, así como los niveles de proteínas modificadas con nitrotirosina para valorar el grado de estrés oxidativo de este biofluido y su relación con la posterior calidad ovocitaria y embrionaria. Para ello, el FFH de 74 mujeres sometidas a tratamiento de inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) (41 grupo control y 33 mujeres infértiles con diferentes diagnósticos) fue recuperado tras la aspiración folicular y recuperación de los complejos cúmulus-ovocito (COCs). El FFH se centrifugó, filtró y almacenó a -20ºC hasta su análisis. La concentración de PT, albúmina y globulinas se determinó mediante la plataforma analítica COBAS c501 utilizando el método de fotometría automatizada - test colorimétrico, mientras que la medición del nivel de proteínas modificadas con nitrotirosina se analizó mediante el test ELISA 3-nitrotirosina (3-NT). Los resultados mostraron una distribución homogénea de las concentraciones de PT, albúmina y globulinas en el grupo control, mientras que en el grupo infértil se observó una gran variabilidad en esta distribución entre los diferentes diagnósticos de las pacientes. El grupo control alcanzó mayores concentraciones proteicas que el grupo infértil: PT (4.92±0.09 g/dl vs. 4.45±0.12 g/dl), albúmina (1.84±0.06 g/dl vs. 1.66±0.04 g/dl) y globulinas (3.08±0.05 g/dl vs. 2.79±0.09 g/dl). Las mujeres con endometriosis e insuficiencia ovárica tuvieron menores concentraciones de PT y albúmina que las mujeres con otros diagnósticos de infertilidad. Por otro lado, no se encontró diferencia en las concentraciones de 3-NT entre el grupo control (28.40±1.79 ng/ml) vs. infértiles (26.83±2.20 ng/ml) ni hubo diferencias dentro del grupo de mujeres infértiles en base a sus diagnósticos. En el capítulo III se estudiaron los polimorfismos en los genes TNP1, TNP2, PRM1 y PRM2 en hombres mestizo ecuatorianos fértiles e infértiles. Para esto se incluyeron 144 hombres (43 control y 101 grupo infértil) a los que se les realizó un espermiograma y una toma de muestra de sangre periférica. Se realizó extracción de ADN en la sangre periférica, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y secuenciación de estos genes. Se identificaron nueve polimorfismos ninguno de los cuales mostraron relación con la fertilidad y no serían factor de riesgo de infertilidad en el varón. Los polimorfismos identificados fueron rs62180545 en TNP1, rs11640138 y rs56069754 en TNP2, rs201923496 y rs737008 en PRM1, rs749752404, rs1646022, rs2070923 y rs182114260 en PRM2. De este grupo, los únicos polimorfismos no descritos previamente en otras poblaciones fueron rs749752404 y rs182114260, ambos en PRM2. En el capítulo IV se estudió los niveles de protaminación/empaquetamiento de la cromatina y expresión de PRM1 y PRM2 (ARN) en espermatozoides de hombres fértiles e infértiles. Para ello se incluyeron 131 individuos (35 grupo control y 96 pacientes infértiles), a los que se les realizó un análisis de semen. La muestra seminal fue sometida a la técnica de selección espermática swim up y dividida en alícuotas en tubos de criopreservación y almacenadas a -196°C hasta su posterior procesamiento. La evaluación indirecta del empaquetamiento de la cromatina en espermatozoides se realizó mediante el ensayo de cromomicina A3 (CMA3), mientras que para la evaluación de la expresión de los genes PRM1 y PRM2, se realizó extracción de ARN, cDNA y PCR en tiempo real con el reactivo Power SYBR® Green PCR Máster Mix. El gen BETA-ACTINA (BA) fue considerado como gen de referencia. En los resultados se observó mayor porcentaje de espermatozoides con CMA3 en el grupo infértil vs. grupo control (15.37±1.00 vs. 12.10 ±1.01, P=0.01). Dentro del grupo control los niveles de CMA3 estuvieron aumentados en individuos con sobrepeso y obesidad tipo I frente al peso normal, llegando estos niveles a ser igual de elevados que los del grupo infértil. También dentro del grupo control, los individuos con varicocele que se sometieron a operación presentaron menores niveles de CMA3 comparados con los individuos no operados. Por otro lado, al evaluar los niveles medios de expresión (ΔCT) de PRM1 y PRM2, así como el ratio PRM1/PRM2, no se encontraron diferencias entre ambos grupos de estudio. Al evaluar la influencia del índice de masa corporal en los resultados, sólo se encontraron diferencias en el ratio PRM1/PRM2 de pacientes infértiles entre individuos con peso normal vs. sobrepeso (P=0.001). Los resultados de este trabajo sugieren que la concentración de proteínas totales del FFH podría ser considerado como marcador dentro del tratamiento de reproducción asistida; y el análisis del estado de protaminación (CMA3) permitiría una identificación de posible causa de infertilidad en hombres catalogados con infertilidad idiopática.