Estudio de las implicaciones funcionales de la proteína oviductina en la fertilidad y el desarrollo embrionario en hámster dorado y conejo utilizando la tecnología CRISPR-Cas9

Resumen

La infertilidad es un problema clínico muy extendido que afecta al 8 12% de las parejas en todo el mundo. De ellas, alrededor del 30% son diagnosticadas de infertilidad idiopática. La infertilidad relacionada con el factor femenino representa alrededor del 40-50% de los casos totales de infertilidad. Dentro de los posibles motivos de infertilidad idiopática, cabe destacar las probables alteraciones presentes en genes implicados en la fecundación y el desarrollo embrionario temprano. Así, las causas genéticas constituyen el 5-10% de todas las mujeres infértiles. El oviducto, denominado trompa de Falopio en la especie humana, y en particular el fluido oviductal (FO) crea un microambiente que interviene en procesos claves para la fecundación y la correcta fisiología del gameto y del embrión. La oviductina o glicoproteína oviductal 1 codificada por el gen OVGP1, es la proteína no sérica mayoritaria en el FO, habiendo sido identificada en diferentes especies de mamíferos, incluido el conejo, el hámster y el ser humano. En base a estas premisas el objetivo principal de la presente Tesis Doctoral ha sido comprobar el papel desempeñado por la proteína oviductina en la fecundación y en el desarrollo embrionario temprano, usando como modelos animales KO (del inglés, knock out) las especies hámster dorado (Mesocricetus auratus) y conejo común (Oryctolagus cuniculus). Este estudio ha permitido valorar si la presencia de oviductina es imprescindible para una correcta función reproductiva en estas especies. El segundo objetivo, también relacionado con el gen OVGP1, fue su análisis filogenético en la subfamilia Murinae. Dentro de esta subfamilia encontramos al ratón, que posee una proteína oviductina funcional, y a la rata, donde OVGP1 es un pseudogen. Este análisis ha permitido datar en qué fecha se produjo dicha pseudogenización, así como determinar qué otras especies se ven también afectadas por este proceso dentro de esta subfamilia. El tercer y último objetivo de esta Tesis está relacionado con el bloqueo de la polispermia. La poliploidía es una condición indeseable que provoca el fracaso del desarrollo embrionario. Para evitarla, el bloqueo de la polispermia impide la fecundación del óvulo por más de un espermatozoide. Dependiendo de la especie de mamífero, el bloqueo de la polispermia se produce a diferentes niveles: el oolema, la zona pelúcida (ZP) o ambos. En el bloqueo de la polispermia a nivel de la ZP, la proteasa ovastacina y la proteína ZP2 desempeñan un papel crucial. En el caso del conejo, el bloqueo de la polispermia se produce a nivel del oolema. Por tanto, el propósito científico ha sido determinar el mecanismo responsable de este proceso, para ello mediante análisis genómico se estudió la existencia de una pseudogenización del gen ASTL, gen codificante de la proteína ovastacina, en lagomorfos. Para el primer objetivo, se comenzó con la caracterizaron de ambos modelos animales KO para OVGP1 mediante experimentos de biología molecular y proteómica. A continuación, se analizó la fertilidad in vivo determinando si la ausencia de la proteína oviductina desencadena alteraciones de la fertilidad en estas especies. Para valorar los motivos causales de dichas alteraciones se realizó un estudio histológico de oviducto, un análisis del desarrollo embrionario preimplantacional, así como un análisis transcriptómico comparado de oviducto y embriones. Para el segundo objetivo se analizó mediante PCR la secuencia genómica del gen Ovgp1 en 22 especies de la subfamilia Murinae, obteniendo el árbol filogenético que nos permite datar la pseudogenización de Ovgp1 en esta subfamilia. Para el tercer objetivo se analizó mediante PCR la secuencia genómica de ASTL en 9 especies de lagomorfos determinando la pseudogenización de ASTL. En conclusión, los modelos animales KO para OVGP1 presentados en esta Tesis han demostrado que la proteína oviductina es esencial para un correcto desarrollo embrionario en hámster, pero no en conejo. El análisis filogenético del gen Ovgp1 en la subfamilia Murinae ha permitido datar su pseudogenización hace aproximadamente 12,5 millones de años, viéndose afectadas, a parte de la rata, otras especies pertenecientes a la tribu Rattini. Finalmente, el análisis genómico de ASTL en lagomorfos ha confirmado su pseudogenización en estas especies, pudiendo ser el motivo por el cual el bloqueo de la polispermia no se produce a nivel de la ZP en estas especies.