Interacción de los fármacos antineoplásicos tamoxifeno y 4-hidroxitamoxifeno con membranas fosfolipídicas

Resumen

Objetivos Dada la elevada naturaleza lipofílica de los fármacos antineoplásicos tamoxifeno (TMX) y 4 hidroxitamoxifeno (HTMX), de amplia utilización en el tratamiento de pacientes con cáncer de mama ER-positivos, el objetivo general de esta tesis es profundizar en el efecto de dichas sustancias sobre la estructura y funcionalidad de las membranas fosfolipídicas. Esto se traduce en los siguientes objetivos específicos: - Estudiar la interacción de TMX y HTMX con membranas fosfolipídicas modelo compuestas del fosfolípido 1,2 dipalmitilfosfatidilcolina (DPPC). - Analizar la influencia de TMX y HTMX sobre la estructura y funcionalidad de sistemas compuestos por el fosfolípido 1,2 dielaidilfosfatidiletanolamina (DEPE). - Caracterizar el mecanismo molecular de la permeabilización de membranas fosfolipídicas modelo de distinta composición, por TMX y HTMX. Metodología En estos estudios se ha seguido fundamentalmente una aproximación biofísica, utilizando técnicas experimentales y simulaciones por dinámica molecular (MD) de amplio uso en este campo. Las técnicas experimentales son las siguientes. - Como modelos de membrana se han usado vesículas multilamelares (MLV) y vesículas unilamelares grandes (LUV). Las MLV se han preparado por el método de hidratación de películas finas, y las LUV por el método de extrusión a través de filtros de policarbonato. - Calorimetría diferencial de barrido (DSC), que permite analizar el efecto de los fármacos bajo estudio sobre el comportamiento termotrópico de fase de los fosfolípidos. A partir de los termogramas obtenidos se han elaborado diagramas parciales de fase para el componente lipídico, que han permitido analizar la influencia de estos compuestos sobre el comportamiento de fase de los distintos fosfolípidos, a saber DPPC, DEPE, y otros. - Espectroscopía de infrarrojo por transformada de Fourier (FTIR), que ha aportado información sobre la interacción droga-fosfolípido a partir del efecto sobre bandas de absorción características tanto de la cabeza polar (fosfato, carbonilo), como de las cadenas acílicas (metileno, metilo terminal). El equipo disponible ha permitido realizar barridos de temperatura y analizar estas interacciones tanto en fase gel, como en fase líquido-cristalina. - Difracción de rayos X, que permite medidas tanto en el ángulo estrecho como en el ángulo ancho. Con este equipo se han obtenido los perfiles de densidad electrónica de los fosfolípidos en ausencia y presencia de TMX y HTMX, analizando su efecto sobre el grosor de la bicapa, la organización de las cadenas acílicas, y el polimorfismo lipídico (formación de fases no lamelares, como la fase hexagonal invertida-HII). - Espectroscopía de fluorescencia. Esta técnica se ha usado en primer lugar para monitorizar el efecto de TMX y HTMX sobre la fluidez de la membrana, usando sondas fluorescentes como el DPH y el TMA-DPH. En segundo lugar, para analizar cuantitativamente la permeabilización de bicapas por TMX y HTMX. Para este fin se ha usado un ensayo de fluorescencia basado en la liberación de la sonda fluorescente carboxifluoresceína encapsulada en el compartimento acuoso de LUV. - Como complemento a los estudios experimentales, se ha llevado a cabo simulaciones de MD. En este tipo de simulaciones se ha construido una bicapa lipídica a partir del fosfolípido seleccionado, y se han incorporado los fármacos bajo estudio, a relaciones molares similares a las usadas en los estudios experimentales. Las simulaciones se han realizado con GROMACS, usando parámetros de campo de fuerza CHARMM36. Las estructuras de membrana iniciales se construyeron usando Packmol, y se usaron barridos productivos en torno a 120 ns. Las representaciones gráficas se hicieron con PyMOL. Resultados TMX y HTMX afectan al comportamiento de fase de DPPC, dando lugar a la formación de dominios enriquecidos en el fármaco dentro de la bicapa (separación lateral de fases). Ambos compuestos se localizan en regiones distintas dentro de la membrana. Por otra parte, TMX permeabiliza membranas fluidas, siendo el efecto de HTMX mucho más débil. La MD apoya la tendencia de estos compuestos a formar agregados dentro de la membrana, y localiza al TMX a todo lo largo de la bicapa, mientras que HTMX se localiza más próximo a la interfase lípido/agua. La incorporación de TMX en bicapas de DEPE produce un ensanchamiento progresivo de la transición de fase Lβ/Lα, y disminuye la temperatura de transición. La transición Lβ/Lα presenta múltiples endotermas, indicando una segregación lateral de dominios TMX/DEPE en el plano de la bicapa. TMX y HTMX también ensanchan y desplazan la transición de Lα/hexagonal-HII. A partir de los diagramas de fase se infiere que ambos compuestos facilitan la formación de la fase no lamelar HII. La FTIR muestra que ni el TMX ni el HTMX perturban de modo significativo el estado de hidratación de la bicapa de DEPE. Las simulaciones de MD indican que estos fármacos no afectan el grosor de la membrana, el área/lípido, o la conformación de las moléculas de DEPE. Sí se muestra una localización distinta para ambos compuestos, y una diferente tendencia a la agregación. El TMX provoca la permeabilización de membranas de POPC de modo rápido y extenso, siendo el efecto del HTMX mucho más débil. Las curvas de salida de contenidos liposomales se ajustan a dos componentes, dando dos constantes de velocidad correspondientes a un proceso lento y otro rápido. Es muy interesante el hecho de que la incorporación de fosfatidilglicerol o fosfatidiletanolamina protege a la membrana de la permeabilización inducida por los fármacos, sugiriéndose una explicación a partir de las simulaciones de MD. La FTIR muestra un aumento de confórmeros gauche y una deshidratación de la región polar de la membrana por efecto de TMX y HTMX. Los resultados aportan nueva información que podría explicar algunas de las actividades de estos fármacos no relacionadas con el receptor de estrógenos, o incluso algunos de sus efectos secundarios. Conclusiones - TMX y HTMX se incorporan a membranas fosfolipídicas y forman dominios segregados en el plano de la bicapa. - El TMX se puede localizar a todo lo largo de la bicapa fosfolipídica, mientras que el HTMX se sitúa más próximo a la interfase lípido/agua. - Estos dos fármacos desordenan la zona de las cadenas acílicas, y deshidratan la región de las cabezas polares de los fosfolípidos de la membrana, siendo los efectos del TMX más significativos. - TMX y HTMX pueden regular la curvatura local de la membrana, y así promover la formación de fases no-lamelares. - TMX, y en menor medida HTMX, permeabilizan membranas compuestas de fosfatidilcolina, permitiendo la liberación del contenido acuoso de las vesículas al medio externo. La magnitud de esta acción se correlaciona con la distinta capacidad de formar agregados y la distinta localización de ambos compuestos. - La permeabilización de membranas inducida por estos fármacos está modulada por la composición lipídica. Así, fosfolípidos como el fosfatidilglicerol y la fosfatidiletanolamina estabilizan la membrana frente a la permeabilización. Esto es debido a un aumento de las interacciones electrostáticas en la región de las cabezas polares, y a la posibilidad de formación de enlaces de hidrógeno, lo que se traduce en una membrana más cohesionada. - Nuestros datos pueden aportar una base molecular para algunas de las actividades farmacológicas de TMX y HTMX no relacionadas con el receptor de estrógenos, o incluso explicar alguno de los varios efectos secundarios que presentan.