Study of Inflammasome Activation in Autoinflammatory Diseases and Tendinopathies

Resumen

Esta Tesis consta de los siguientes objetivos: 1. Determinar el efecto de mutaciones en NLRC4 asociadas a enfermedades autoinflamatorias en la estructura de NLRC4. 2. Evaluar la activación de los inflamasomas NLRC4 y NLRP3 por microscopía de fluorescencia. 3. Caracterizar el efecto de la corriente galvánica en la activación del inflamasoma NLRP3 en macrófagos. 4. Estudiar la implicación del inflamasoma NLRP3 en la respuesta inflamatoria y regenerativa tras la aplicación de electrolisis percutánea en tendón de Aquiles de ratón. 5. Elucidar el rol del inflamasoma NLRP3 en un modelo murino de daño tisular estéril. Para conseguirlos, se realizaron estudios in vitro utilizando cultivos celulares de macrófagos silvestres y deficientes en diferentes componentes del inflamasoma. Tras activarlos con LPS y corriente galvánica se determinó la liberación de diferentes citoquinas pro-inflamatorias como IL-1β o IL-18, así como la liberación de LDH y la captación de YoPro-1. Además, se utilizó microscopía de fluorescencia, así como la técnica BRET para estudiar la oligomerización y conformación, respectivamente, del inflamasoma. Por otro lado, se realizaron estudios ex vivo, utilizando sangre de pacientes con enfermedades autoinflamatorias para aislar células mononucleares de sangre periférica, activar específicamente NLRP3 con LPS+ATP y NLRC4 con LPS+FlaTox, y medir la liberación de IL-1β, IL-18, IL-6 y TNF-α por ELISA, y la formación de oligómeros de ASC por citometría. También se realizaron estudios in vivo utilizando ratones silvestres, Nlrp3-/- y Pycard-/- para medir la expresión de diferentes citoquinas pro-inflamatorias, y el tipo, orientación y fuerza de las fibras de colágeno mediante tinción con rojo picrosirio, microscopia de segundo armónico y pruebas biomecánicas, tras aplicar electrolisis percutánea o punción seca. Además, se midió la expresión y la producción de IL-1β, IL-18, TNF-α e IL-6 por qPCR y ELISA, respectivamente; y se cuantificaron células polimorfonucleares por tinción con hematoxilina-eosina, tras inducir un daño en el tendón aplicando la enzima colagenasa. Finalmente, se aplicó electrolisis percutánea o punción seca en los tendones tratados con colagenasa. Esta Tesis ha generado las siguientes conclusiones: 1. Las mutaciones que afectan al dominio WHD inducen cambios en la conformación de NLRC4. 2. Los diferentes mutantes de NLRC4 descritos en pacientes con enfermedades autoinflamatorias inducen una distribución punteada de NLRC4. 3. La mutación p.Ser171Phe de NLRC4 presenta ganancia de función en el ensamblaje del inflamasoma. 4. La mutación p.Ser171Phe de NLRC4 es una posible causa del síndrome autoinflamatorio que sufre la paciente a estudio. 5. La aplicación de corriente galvánica en células HEK293T que expresan NLRP3 induce una distribución punteada de NLRP3. 6. La aplicación de corriente galvánica en macrófagos tratados con LPS activa el inflamasoma NLRP3. 7. La aplicación de corriente galvánica en macrófagos tratados con LPS induce la liberación de las citoquinas IL-1β e IL-18. 8. La aplicación de corriente galvánica en macrófagos tratados con LPS no induce muerte celular por piroptosis. 9. Aumentar el tiempo y el número de pulsos en la corriente galvánica aplicada a macrófagos tratados con LPS está relacionado con un aumento en la liberación de IL-1β y una muerte celular dependiente de la corriente. 10. La electrolisis percutánea aplicada al tendón de Aquiles de ratón induce un incremento en el colágeno tipo I y la rigidez del tendón, mejorando su resistencia. 11. La resistencia del tendón tras aplicar electrolisis percutánea es dependiente del inflamasoma NLRP3. 12. La administración de colagenasa en el tendón de Aquiles de ratón induce daño tisular estéril y una respuesta inflamatoria parcialmente dependiente de NLRP3. 13. El daño inducido por colagenasa en tendón de Aquiles de ratón no está afectado por la electrolisis percutánea aplicada 3 veces cada 3 días con 3 impactos de 3 mA durante 3 segundos.