Estudio de la familia de proteínas quinasas C como nodos de control en la señalización celular

Resumen

La Tesis Doctoral realizada ha profundizado en el conocimiento de la función de diferentes isoformas de la familia PKC, como son PKCα y PKCε, a través del estudio de su señalización en diferentes procesos celulares. Durante esta Tesis Doctoral, se ha estudiado y caracterizado la señalización mediada por PKCα en dos subtipos concretos de cáncer de mama: subtipo Luminal A, utilizando las células MCF-7 como modelo; y el subtipo basal o triple negativo, donde las células MDA-MB-231 fueron empleadas como modelo celular. Para comprender cómo la señalización por PKCα participaba en la regulación y desarrollo del proceso tumoral en las células MDA-MB-231, se ha desarrollado una línea celular que presenta inhibida la expresión de PKCα de manera estable a través del uso de la herramienta de edición genética CRISPR-Cas9. A través del estudio morfológico y funcional de esta línea celular modelo, y su comparación con la línea silvestre, ha sido posible identificar como la falta de PKCα y su señalización provoca alteraciones morfológicas en las células, afectando principalmente al citoesqueleto y a su organización tridimensional. Además, se identificó a PKCα como una quinasa importante en procesos tumorales como son la migración o invasión celular, viéndose seriamente afectados. Para profundizar en cómo PKCα provoca estas alteraciones en la morfología y funcionalidad de las células MDA-MB-231, se realizó un estudio proteómico comparado entre ambas líneas, donde se analizó el estado de activación del quinoma celular tras la inhibición de PKCα, así como el proteoma y fosfoproteoma. La integración de esta información permitió identificar a PKCα como un elemento importante para el correcto funcionamiento del ciclo celular, así como su papel en la regulación del citoesqueleto y procesos de motilidad celular a través de la regulación de la expresión y/o actividad de proteínas estructurales y componentes esenciales como las pequeñas GTPasas. Esta información fue utilizada para el desarrollo de una terapia combinada donde la inhibición de PKCα actúa como elemento central, identificando así el papel oncogénico de la isoforma en el cáncer de mama triple negativo. De manera análoga, se llevó a cabo el estudio de las rutas y vías de señalización donde PKCα aparece implicada en las células MCF-7, a través de su inhibición mediante pequeños ARN de interferencia. La información recogida de aquellas proteínas que experimentaban alteraciones en su expresión tras la inhibición de PKCα, sumada a la identificación del estado de activación de diferentes quinasas a través del array de quinasas, mostró a PKCα como una quinasa clave en la regulación de numerosas rutas necesarias para el desarrollo tumoral. Así, la ruta de señalización de las MAP quinasas, PI3K-AKT, señalización por interferón o p53, se vieron afectadas tras la inhibición de PKCα. Esta información, sumada a la alteración funcional que experimentan las células MCF-7, sitúan a PKCα como una quinasa oncogénica en este subtipo tumoral mamario. Para finalizar, se estudió cómo PKCε participa en los procesos de desgranulación celular en células RBL-2H3. El ácido fosfatídico se trata de un importante fosfolípido de membrana que aparece implicado en muchas funciones y eventos de señalización. Sin embargo, cómo su regulación afecta a la funcionalidad de PKCε en estas células no se conocía. Los resultados, obtenidos a través del uso de la microscopía TIRF, revelaron como esta señalización ejercería un papel de estabilización y preparación de las vesículas para los procesos de fusión vesicular a través de fenómenos de fosforilación sobre SNAP23, preparándolas así ante posibles estímulos de calcio que den lugar a la desgranulación de las células RBL-2H3. Estos resultados sitúan a PKCε como posible diana en reacciones alérgicas o desencadenadas por la activación de células mastoides.