Mechanisms involved in the inflammatory process of gilthead seabream (Sparus aurata)

Resumen

La inflamación es una respuesta inespecífica desencadenada por el sistema inmunitario innato frente a cualquier estímulo de diversa etiología para defender el organismo, en este caso el de peces, y devolverlo a la homeostasis inicial. La inflamación presenta una serie de síntomas muy característicos y por los que puede ser fácilmente identificable cuyo conjunto recibe el nombre de “Signos cardinales de la inflamación”, y se pueden diferenciar dos tipos de inflamación: i) la inflamación aguda, o respuesta inmediata, la cual puede desarrollarse de forma breve ante la detección del estímulo inicial, y durar días o semanas hasta su final resolución; y ii) la inflamación crónica, producida ante la ineficacia de los mecanismos defensivos para resolver la inflamación aguda y cuyos efectos están altamente relacionados con la aparición de enfermedades crónicas . La inflamación es un evento muy común que ocurre en acuicultura debido a las intensas condiciones de producción a los que son sometidos los peces para cubrir las demandas del mercado. Este escenario hace a los animales más susceptibles a heridas, traumatismos e infecciones por patógenos, lo que podría estar relacionado con la aparición de enfermedades asociadas, que muchas veces se traducen en pérdidas económicas para el propio sector. La inflamación supone un mecanismo esencial para devolver a los peces a su estado inicial de salud, ya que participa de forma directa en la reparación del tejido dañado. No obstante, hasta la fecha no se ha desarrollado ningún modelo inflamatorio en peces que permita profundizar en sus mecanismos de inflamación y salud de manera adecuada. La presente Tesis Doctoral pretende mejorar el conocimiento sobre el proceso de inflamación de la dorada (Sparus aurata), una de las especies de interés en acuicultura más importantes del Mar Mediterráneo. Para alcanzar nuestro objetivo dividimos esta Tesis Doctoral en tres capítulos. En el Capítulo I se evaluaron los efectos sistémicos provocados por una inyección de carragenina. Los peces fueron inyectados intramuscularmente con PBS (control) o carragenina (1%) y tras 1,5, 3 y 6 horas se tomaron muestras de moco de la piel, suero, riñón cefálico e hígado para determinar el estado inmunológico y antioxidante en la dorada. Los resultados evidenciaron que una inyección intramuscular de carragenina al 1% es suficiente para provocar inflamación en los ejemplares, provocando además un aumento de actividades inmunitarias humorales en el moco de la piel a las 3 horas de la inyección. Sin embargo, la inyección de carragenina no tuvo repercusiones en la inmunidad sistémica de la dorada. Además, aunque se observó una disminución de la actividad de la catalasa en el hígado a las 3 y 6 horas después de la inyección, no se detectaron variaciones significativas en la expresión de ninguno de los genes estudiados en el hígado, evidenciando que este órgano no se vio afectado por la inyección de carragenina. El Capítulo II de esta Tesis Doctoral consistió en el estudio de los efectos locales desencadenados por la carragenina en el lugar de la inyección. Así, los animales fueron inyectados intramuscularmente con PBS (control) o carragenina, tomando muestras de piel para el estudio histológico e inmunohistoquímico y para el análisis de la expresión génica a 1,5, 3 y 6 horas después de la inyección. Los resultados evidenciaron un aumento en el número de células mucosecretoras de la piel y de granulocitos acidófilos en la piel a las 1,5 y 3 horas después de la inyección, respectivamente. Considerando los resultados obtenidos, se diseñó otro ensayo donde los peces fueron inyectados intramuscularmente con PBS (control) o con carragenina, y la zona de inyección fue evaluada mediante ecografía en tiempo real y micro-CT a las 1,5, 3, 6, 12 y 24 horas después de la inyección. Los resultados evidenciaron los síntomas típicos de la fascitis necrosante humana (aumento del grosor de la piel, edema y enfisema) en el músculo subyacente de los animales inyectados a las 1,5, 3 y 6 horas, los cuales se redujeron hasta desaparecer a las 12-24 horas de la administración de la carragenina. Esta sintomatología parece deberse a las moléculas liberadas en el sitio de la inflamación y a la posible degradación de la carragenina en dicho lugar, lo que apuntaria en ultimo lugar a las etapas finales de la respuesta inflamatoria. En el Capítulo III de la presente Tesis Doctoral se incluyeron los resultados obtenidos del análisis génico de la respuesta inflamatoria provocada por la carragenina en la dorada. Para ello, la expresión de 40 genes relacionados con la inflamación se evaluó in vivo en dos ensayos que se llevaron a cabo por separado. En el primer experimento, los especímenes de dorada fueron inyectados con PBS (control) o carragenina por vía intramuscular, y después de 1,5, 3 y 6 horas se recolectaron las muestras de piel del área inyectada y se procesaron para evaluar la expresión génica. En el segundo ensayo se replicó el mismo diseño experimental, pero aumentando el tiempo de muestreo a 12 y 24 horas. El incremento de marcadores celulares y la expresión de genes pro-inflamatorios, así como la disminución de genes anti-inflamatorios en el intervalo de 1,5 a 6 horas después de la inyección, indicaron la duración de la inducción de la respuesta inflamatoria provocada por la carragenina. No obstante, los resultados obtenidos a las 12 y 24 horas después de la inyección parecieron indicar la activación de mecanismos necesarios para terminar la respuesta inflamatoria inducida por la carragenina, restaurando la homeostasis de la piel. Estos resultados fueron respaldados por un ensayo in silico en el que se estudió la conservación filogenética de las 40 moléculas previamente estudiadas por expresión génica a partir de secuencias de proteínas de dorada en comparación con otras secuencias proteicas de teleósteos, presentando las proteínas de la corvina amarilla (Larimichthys crocea L.) los mayores porcentajes de identidad con las secuencias proteicas de la dorada. Además, las proteínas de la inflamación más conservadas fueron aquellas implicadas en su regulación, hecho que apoya la hipótesis de que los mecanismos génicos reguladores podrían activarse 24 horas después de la inyección de la carragenina para controlar la respuesta inflamatoria. Finalmente, todos los hallazgos de esta Tesis Doctoral evidencian que una sola inyección de carragenina al 1% puede ser utilizada para desencadenar una inflamación local en doradas, lo que constituye un modelo para continuar estudiando este proceso, tanto en la salud como en la enfermedad en esta especie.