Microscopía multifotónica del ojo humano en vivodesarrollo y optimización de un dispositivo compacto para uso clínico

Resumen

Durante las últimas décadas la microscopía multifotónica se ha convertido en una herramienta de gran utilidad para visualizar tejidos biológicos. En particular, la microscopía de generación de segundo armónico (SHG, del inglés Second Harmonic Generation) tiene una ventaja importante respecto a métodos de microscopía convencionales, debido a su capacidad para observar tejidos formados por colágeno tipo I, como la esclera y la córnea, sin necesidad de operaciones de teñido y fijado. Dichas estructuras oculares son las que vamos a estudiar en esta Tesis Doctoral. Para ello, presentamos un prototipo de microscopio multifotónico compacto que nos servirá para examinar el segmento externo del ojo humano en vivo. Este nuevo sistema requiere una calibración de los parámetros de adquisición de imágenes óptimas en tiempos de exposición reducidos, buscando un compromiso entre la calidad de imagen y la seguridad de los tejidos bajo estudio. La evaluación de la calidad de imágenes, registradas con diferentes parámetros, ha permitido confirmar que se pueden obtener imágenes óptimas, con alta resolución, en tiempos de exposición menores de 1 s. Una vez evaluadas las condiciones de registro óptimo, fue necesario saber si el sistema es apto para su uso en vivo, teniendo en cuenta parámetros de la fuente láser, el tiempo de exposición y el ángulo visual, siguiendo la norma ANSI Z136.1. Los cálculos de la exposición máxima permitida (Maximum Permissible Exposure, MPE) para el microscopio multifotónico indican que es seguro para las condiciones experimentales propuestas. Tras el análisis de seguridad, se procedió al registro de imágenes en condiciones en vivo en ojos de voluntarios sanos, registrando imágenes de la córnea, la esclera y el limbo esclerocorneal, con suficiente resolución como para detectar fibras y células individuales, comparables a condiciones ex vivo, con alta repetibilidad. En algunos casos, movimientos involuntarios del ojo, pueden dar lugar a una degradación de la imagen. Además, como en todas las muestras biológicas, en el ojo también se producen fenómenos tipo scattering, reduciendo la calidad de las imágenes. Por esta razón se ha propuesto la mejora de imágenes multifotónicas mediante diferentes técnicas. Se ha analizado la utilidad de un procedimiento de deconvolución ciega marginal. Este método permite restaurar imágenes cuando se cuenta con poca información del sistema experimental, sin necesidad de supervisar el proceso. Con su aplicación se mejora la calidad de las imágenes deconvolucionadas, así como su resolución, en comparación a las imágenes originales. Otro método para mejorar las imágenes registradas ha sido el uso de luz polarizada radialmente, mediante una lámina “S-waveplate”. Las imágenes adquiridas con la luz radial se han comparado con imágenes registradas, cuasi simultáneamente, con luz polarizada circularmente. El aumento en la calidad de imágenes adquiridas con luz radial es destacable, especialmente con la profundidad, donde las imágenes se degradan más debido a las aberraciones y el scattering. Finalmente, se han comparado imágenes registradas con un láser de pulsos de menos de 10 fs, con dimensiones reducidas y mayor flexibilidad para la implementación de un prototipo de microscopio multifotónico clínico, y con un láser de Ti:Zafiro de más de 120 fs, de grandes dimensiones y alto coste. Los resultados muestran que el primero se ve más afectado por la acción de la dispersión cromática, por lo que es necesario aumentar la potencia de salida del láser para obtener imágenes de cualidades similares a las adquiridas con el láser de Ti:Zafiro. Los métodos de mejora aplicados, con mayor o menor éxito, permiten obtener imágenes multifotónicas óptimas que aportan información sobre las estructuras de la córnea y la esclera, sin poner en riesgo la integridad de los tejidos, ya que se mantienen varios órdenes de magnitud por debajo de los niveles de exposición máximos permitidos para el ojo humano.