Toxicidad producida por metales en peces teleósteosefectos sobre la viabilidad, protección e inmunidad celular

Resumen

La presente Tesis Doctoral pretende estudiar los efectos tras la exposición a metales mediante estudios in vitro en líneas celulares y cultivos primarios procedentes de dorada (Sparus aurata) y de lubina (Dicentrarchus labrax), dos de las especies marinas más importantes en acuicultura. Concretamente, se han usado dos líneas celulares (SAF-1, línea comercial procedente de aleta de dorada; y DLB-1, una línea celular generada durante esta Tesis en nuestro laboratorio a partir de explantes de cerebro de lubina) y tres cultivos primarios (eritrocitos y leucocitos de riñón cefálico (HKLs) y de sangre (PBLs)) procedentes de dorada y lubina para evaluar los efectos citotóxicos de los metales Cd, Hg, Pb y As. Además, hemos estudiado el estrés oxidativo inducido por dichos metales, mediante evaluación de la producción de ROS y la expresión de genes relacionados con la actividad antioxidante así como la expresión génica de proteínas relacionadas con mecanismos de protección celular. Además, se han analizado los tipos de muerte celular tras la exposición a metales y por último, se han determinado los efectos que los metales pueden causar en la respuesta inmunitaria de los leucocitos de dorada y lubina. Para ello, las líneas celulares fueron expuestas a los metales y la viabilidad fue medida mediante varias técnicas colorimétricas, como son el NR, MTT, CV o LDH. En el caso de los cultivos primarios de leucocitos, usamos el fluorocromo PI y citometría de flujo ya que las poblaciones en este caso son heterogéneas (linfocitos, monocitos-macrófagos y granulocitos), y para los eritrocitos, además del PI, usamos una técnica basada en la liberación de HbO2. Para evaluar el estrés oxidativa provocado por los metales, medimos la capacidad de las células para producir H2O2 y la expresión de genes relacionados con los sistemas antioxidantes (sod, cat, gr, prx) y con la protección celular (mta, hsp) mediante PCR a tiempo real. Por otra parte, para estudiar los mecanismos de muerte celular tras la exposición a metales, evaluamos la abundancia de células en apoptosis y/o necrosis usando PI y FDA/Anexina, y estudiamos la expresión de genes involucrados en la apoptosis (bax, bcl2 o casp3) mediante PCR a tiempo real. Además, las células SAF-1 fueron analizadas mediante microscopía electrónica de barrido, y el ciclo celular fue analizado en las DLB-1. Finalmente, el efecto inmunotoxicológico de los metales sobre la fagocitosis y el estallido respiratorio (principales respuestas inmunitarias innatas celulares) y la expresión de los genes ighm, tcrb, mx, bd, hepc, il1b, phox22 y phox40 fue estudiado en los leucocitos de dorada y lubina. Como conclusión, hemos generado una línea celular de cerebro de lubina denominada DLB-1 cuyo origen parece glial. Además, la exposición a los metales Cd, Hg, As y Pb en las líneas celulares y cultivos celulares primarios de dorada y lubina produjo una reducción en la viabilidad dosis-tiempo dependiente. El MeHg resultó ser el metal más tóxico, excepto para la línea celular DLB-1, mientras que el Pb fue el menos citotóxico. Entre los cultivos celulares primarios, los eritrocitos son las células más sensibles a la exposición de metales, seguidos de los leucocitos de riñón cefálico y los leucocitos de sangre. Comparando las dos especies estudiadas, las células de lubina son más resistentes a la exposición por metales que las de dorada. Por otra parte, la exposición a metales induce los sistemas de protección celular y antioxidantes, los cuáles son incapaces de compensar la sobreproducción de ROS, desencadenando el estrés oxidativo, el cual conlleva a la muerte celular, principalmente por apoptosis. Además, la respuesta inmunitaria de los leucocitos de riñón cefálico de dorada y lubina se vio disminuida tras la exposición a metales tanto a nivel génico como funcional. Así, ambas líneas celulares y los cultivos celulares primarios de peces empleados son herramientas valiosas para estudiar los mecanismos de la toxicidad producida por metales. Además, los eritrocitos de dorada y lubina deberían ser incluidos como modelo in vitro en estudios de Toxicología.