Bases moleculares de la interacción, de proteínas de transporte vesicular

Resumen

Las vesículas intracelulares se transportan de un orgánulo a otro en respuesta a distintos estímulos. La dirección y eficacia de la entrega de vesículas hasta su membrana de destino están mediadas por la señalización celular, llevada a cabo por numerosas proteínas y segundos mensajeros. Rabfilina3A (Rph3A) es una proteína del tráfico de membranas, sensible a dos segundos mensajeros, calcio (Ca2+) y fosfatidil inositol 4,5-bisfosfato (PIP2). PKCε es una proteína quinasa implicada en rutas de señalización que actúa fosforilando a otras proteínas, y responde a distintos lípidos como diacilglicerol (DAG) y ácido fosfatídico (PA). Nuestro grupo de investigación en colaboración con el Instituto de Biología Molecular de Barcelona, han resuelto las estructuras 3D de los dominios C2 de Rabfilina3A unidos a Ca2+ y PIP2, y también del dominio C2B unido a SNAP25. Además, se determinó previamente que PKCε responde a PA. Por tanto, uno de los objetivos de esta tesis doctoral fue caracterizar la función de Rabfilina3A y descubrir nuevas proteínas moduladoras de su función. El segundo objetivo fue investigar el papel que podría tener el PA sobre PKCε en la secreción de vesículas de los mastocitos. Para lograr estos objetivos, se utilizaron técnicas de biología molecular para clonar y mutar genes. Se usaron dos líneas celulares como modelos vivos: la línea celular PC12 como modelo adrenal, también diferenciada con factor de crecimiento neuronal (NGF) a un modelo neuronal, y la línea celular RBL-2H3 como modelo de mastocitos. Se empleó el ensayo de ligación por proximidad (PLA) con microscopía confocal para estudiar la localización e interacciones proteína-proteína. Además, se utilizaron técnicas "ómicas" para la identificación masiva de proteínas cercanas a Rabfilina3A, acoplando la técnica de marcaje por proximidad dependiente de biotina (BioID2) con espectrometría de masas. Los resultados obtenidos muestran que el dominio C2B de Rabfilina3A presenta una fuerte región electropositiva, en la zona de interacción con SNAP25 que no está conservada en Sinaptotagmina1. Rabfilina3A parece interaccionar con VAMP2, Sinaptotagmina1 y SNAP25 en las vesículas de transporte, pero sólo con SNAP25 y Sinaptotagmina1 en la membrana plasmática. La zona de interacción de SNAP25 con Rabfilina3A, y la interacción de Rabfilina3A con PIP2 parecen ser claves para la correcta localización de SNAP25 en la membrana plasmática. Además, la sobreexpresión de Rabfilina3A en un fenotipo neuronal promueve la localización de SNAP25 en la membrana plasmática. Se caracterizó el interactoma circundante a Rabfilina3A y se descubrió que Rabfilina3A interacciona con STIM1, y Tcp11l1. STIM1 es una proteína del retículo endoplasmático (RE) encargada de detectar y ayudar a restaurar los valores de Ca2+ en el RE. Tcp11l1 es una proteína de función desconocida. El interactoma realizado de Tcp11l1 muestra que es una proteína que interacciona con proteínas del citoesqueleto como tubulina y β-actina. En consecuencia, en relación con el primer objetivo de este tesis, se propone un modelo en el que Rabfilina3A contribuye al transporte de vesículas y de SNAP25 a la membrana plasmática gracias a la interacción con Tcp11l1, posteriormente Rabfilina3A vuelve a su situación de partida gracias a STIM1. Los resultados del segundo objetivo sugieren que el borde del bolsillo de unión a DAG del dominio C1B de PKCε es fuertemente electropositivo permitiendo su unión a PA. La activación de PKCε por PA junto con el Ca2+ desencadena un incremento de la fusión de vesículas en mastocitos. Este hallazgo se correlaciona con el aumento de la fosforilación de SNAP23 en respuesta a la interacción de PKCε con PA. Por tanto, se sugiere un modelo en el que PKCε es activada por PA y fosforila a SNAP23 facilitando la fusión de vesículas.