Caracterización estructural y funcional de proteínas quinasas C y su interacción con proteínas moduladoras y sustratos

Resumen

En la presente Tesis Doctoral se ha llevado a cabo el análisis biofísico y estructural de importantes proteínas pertenecientes a la familia de las quinasas PKCs. Además, también se ha relacionado el estudio con proteínas con las que interaccionan, Fascin1, un importante sustrato de PKCα con un papel fundamental en la dinámica espaciotemporal dentro del citoesqueleto de F-actina y, por otra parte, una proteína con un papel fundamental en la localización celular en membrana de las PKCs, RACK1. Todo ello en conjunto con diversas combinaciones de aditivos (CaCl2, el éster de forbol P13A, ADP y MgCl2), que tienen importancia modulando la actividad de estas quinasas. Por medio de técnicas de cristalografía de rayos X y criomicroscopía electrónica, se realizó un amplio estudio de cribados de cristalización y preparación de rejillas de CryoEM para las quinasas PKCs junto con las proteínas moduladoras y sustratos anteriormente mencionados. Desafortunadamente, no se obtuvieron cristales con la presencia de alguna de las PKCs objeto de estudio ni datos por medio de CryoEM que permitiera la determinación estructural atómica o casi atómica de las proteínas PKCs. No obstante, a través de CryoEM conseguimos determinar condiciones preliminares, que resultaron en clasificaciones 2D en las que podíamos interpretar un posible modelo de interacción para el complejo PKCα-Fascin1 y con un gran potencial de poder determinar estructuralmente a nivel atómico dicho complejo mediante la mejora de la toma de datos inicial. También se realizaron diversas técnicas biofísicas tales como Thermal Shift Assay que permitieron inferir modos de unión diferentes para PKCα y Fascin1 dependiendo de la combinación de aditivos añadidos al medio. Por medio de SPR también se determinó que la mayor afinidad entre Fascin1 y PKCα se producía con la versión silvestre de Fascin1 junto con todos los aditivos que se probaron (CaCl2, el éster de forbol P13A y ADP-MgCl2). Estudios de tomografía por medio de CryoEM permitieron determinar la unión de Fascin1 a los filamentos de F-actina de forma discreta mediante el empleo de un mutante de Fascin1 que afecta a uno de los dos sitios principales de interacción con F-actina. En la actualidad, el proyecto se encuentra en una fase avanzada previa a la determinación estructural atómica de dicha interacción. Por otra parte, también se realizaron ensayos de rescate de fármacos que fueran capaces de interaccionar con el bolsillo de unión a PIP2 del dominio C2 de PKCα y que pudiera tener algún efecto en la capacidad de la quinasa en reconocer la membrana. Sin embargo, después de realizar ensayos biofísicos de FRET y sedimentación lipídica, así como ensayos celulares acoplados a microscopía confocal, no se consiguió asignar a ninguno de los fármacos un papel interfiriendo en la habilidad de la proteína reconociendo la membrana. No obstante, por medio de cristalografía de rayos X se determinó que uno de los compuestos estudiados era capaz de interaccionar con el bolsillo de unión al fosfoinosítido PIP2. A pesar de los enormes retos estructurales que presentan estas proteínas PKCs (asimetría, pequeño tamaño y la capacidad de adoptar múltiples conformaciones haciendo de ellas proteínas muy flexibles) y que hacen que hasta la fecha no haya información estructural completa para ninguna de sus isoformas, se ha conseguido obtener información de gran valor y con potencial de poder avanzar con el estudio estructural para acercarnos a la resolución atómica del complejo PKCα-Fascin1. Esto podría ayudar a resolver el gran problema que existe hoy día en el desarrollo de fármacos específicos de diana para esta familia de quinasas y así poder luchar contra el cáncer, una de las principales enfermedades en las que las proteínas PKCs se encuentran involucradas.