A microplate adaptation of the thiobarbituric acid reactive substances assay to determine lipid peroxidation fluorometrically in small sample volumes

Resumen

El presente trabajo adapta un ensayo sencillo, rápido, reproducible y económico de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS) para su uso en espectrofluorómetro para microplacas. La técnica permite un análisis rápido de múltiples muestras y requiere un mínimo volumen de muestra (50 µl de un homogeneizado de eritrocitos de aves paseriformes a una concentración proteica de 3.4- 8.9 mg/ml en este estudio), lo cual resulta de especial interés en estudios de biomonitorización que trabajan con animales de pequeño tamaño de los que se puede obtener una cantidad de muestra limitada. El ensayo TBARS consiste en la reacción del ácido tiobarbitúrico (TBA) con malondialdehído (MDA) en condiciones de calor (90°C), formando productos que pueden medirse fluorométricamente usando microplacas negras de 384 pocillos a 532/553 nm de excitación/emisión. La concentración de peróxidos lipídicos en la muestra se determinó por extrapolación de una curva de MDA. Se utilizaron dos combinaciones diferentes de excitación/emisión (532/553 and 530/550 nm) y ambas fueron apropiadas para la técnica. La variabilidad intra- e inter-placa fue < 20% y se observó una buena linealidad de la curva estándar (R2 > 0.99). El uso científico de la adaptación a microplaca del ensayo TBARS proporcionará más datos y comprensión sobre la peroxidación lipídica reduciendo la limitación que supone los pequeños volúmenes de muestra.