Evaluación de la recombinasa reca sobre la unión espermatozoide-adn exógeno en la transgénesis mediada por espermatozoides en la especie porcina

Resum

La transgénesis mediada por espermatozoides (SMGT) es un método de producción de animales transgénicos. Se basa en la capacidad que presentan los espermatozoides de unir ADN exógeno y transferir el transgén a los ovocitos. Por otro lado, la proteína recombinasa de origen bacteriano RecA protege las cadenas simples de ADN de la degradación, al crear una capa protectora. Este hecho da lugar a una mayor producción de embriones viables e integración del transgén en animales producidos mediante microinyección pronuclear e ICSI. El objetivo de este estudio fue investigar la capacidad de transferencia de los complejos RecA:ssADN en espermatozoides de cerdo, así como la viabilidad de los mismos mediante citometría de fl ujo. En primer lugar, se recolectó el semen y se centrifugó para eliminar el plasma seminal. Se utilizó el plásmido EGFP que fue incubado con los espermatozoides a 16º C (grupo control). Para el grupo RecA, en primer lugar se desnaturalizó el ADN (95ºC, 5 min) y seguidamente, se incubó con la proteína RecA en hielo durante 1h, transcurrido este tiempo estos complejos (RecA:ssADN) formados se incubaron con los espermatozoides a 16ºC. La incubación en presencia de la recombinasa RecA supuso un aumento signifi cativo del porcentaje de células unidas al ADN con respecto a espermatozoides intactos incubados únicamente con el gen EGFP (Control: 19.68±0.73% vs. RecA: 24.69±0.70%; p<0.01). Los resultados mostraron que para ambos grupos la unión se produce principalmente a células no viables (Control: 19.21±0.71% vs. RecA: 24.11±0.69%; p<0.01), y en una muy baja relación a espermatozoides viables (Control: 0.47±0.09% vs. RecA: 0.58±0.09%; p=0.40). Con este estudio hemos demostrado que los complejos RecA:ssADN interaccionan con los espermatozoides porcinos en mayor proporción que para el caso de los espermatozoides únicamente incubados con el transgén, y para ambos casos esta asociación se produce principalmente a células no viables. Por lo 60 AN. VET. (MURCIA) 25: 59-69 (2009). EVALUACIÓN DE LA INTERACCIÓN ESPERMATOZOIDE-COMPLEJO RECA:SSADN. GARCÍA-VÁZQUEZ F. A. INTRODUCCIÓN La transgénesis es una potente herramienta biotecnológica para la generación de animales modifi cados genéticamente con aplicaciones en diferentes áreas como la medicina veterinaria, biomedicina y agricultura. La microinyección pronuclear del ADN ha sido el método más utilizado para la generación de animales transgénicos, en especial en el ratón (Gordon 1981). Esta técnica, aunque efectiva, es poco efi ciente, resultando en menos del 5% de animales transgénicos (Niemann y Kues 2000; Nakanishi y cols., 2002; Wall 2002). En 1989, Lavitrano et al. describen un nuevo método para la producción de animales transgénicos, denominado transgénesis mediada por espermatozoides (SMGT). Este método esta basado en la habilidad intrínseca que presentan los espermatozoides de unir ADN exógeno y transferir el transgén a los ovocitos, e integrarse en el genoma del nuevo embrión. Sin embargo, aunque la SMGT ha sido utilizada en diferentes especies, los resultados presentados hasta el momento son muy dispares (revisado por Smith y Spadafora 2005). Desde su descubrimiento, la técnica de SMGT se ha combinado con diferentes metodologías para incrementar su efi ciencia, como por ejemplo, el uso de técnicas como la electroporación o lipofección, o incluso la utilización de anticuerpos como nexo de unión entre los espermatozoides y el transgén (revisado por Smith y Spadafora, 2005). Otra reciente innovación ha sido el uso de la inyección intracitoplasmática del espermatozoide (ICSI) en combinación con la técnica de SMGT. Esta técnica se ha denominado transgénesis mediada por ICSI (Perry y cols., 1999), y que ha sido aplicada con éxito en la especie porcina (Lai y cols., 2001; Kurome y cols., 2006; García-Vázquez 2008). tanto se podría utilizar la SMGT combinada con técnicas de reproducción asistida como la ICSI para la obtención de embriones y lechones transgénicos.