Desarrollo de nuevas herramientas biotecnológicas para la Industria de la energíaNuevos biocatalizadores avanzados

Résumé

Introducción Entre las moléculas estudiadas históricamente para la producción de biocombustibles sostenibles, la familia química de los alcoholes se encuentra entre los compuestos más ampliamente investigados debido a sus buenas propiedades y a la capacidad de multitud de microorganismos de producirlos de manera natural. Por ello, en la última década, numerosos grupos científicos han dedicado sus esfuerzos a explorar sus posibilidades y exprimir el potencial de su producción microbiológica (W. Jiang et al., 2018; Lamsen & Atsumi, 2012; Liao et al., 2016). Entre estos, los alcoholes superiores presentan un mayor interés debido a que a medida que aumenta la complejidad de su estructura molecular, mejoran sus propiedades como combustibles. El aumento de número de carbonos aumenta su densidad energética y disminuye su higroscopicidad, mientras que la introducción de ramificaciones en la molécula influye en su capacidad antidetonante, conocida como número de octano, propiedad esencial en motores de explosión (Bai et al., 2019; Toogood & Scrutton, 2018). En una investigación llevada a cabo en el Departamento de Combustibles de Repsol Technology Lab, se evaluó el potencial de 29 estructuras moleculares de alcoholes superiores para ser usados como mejoradores en las mezclas de gasolinas o como potenciales sustitutos. Entre estos, la molécula 2-etil-1-butanol fue seleccionada como el candidato ideal (Alcalde-Bascones, 2013). Existen cinco rutas metabólicas principales a través de las cuales se puede producir alcoholes superiores en microorganismos (W. Jiang et al., 2018; Nozzi et al., 2014). Entre ellas, la mayoría de ramificaciones posibles consisten Resumen ii en la presencia de un grupo metilo lateral y son obtenidos a través de la ruta de los α-cetoácidos (Bai et al., 2019). La molécula 2-etil-1-butanol es un producto no natural para el cual no se encuentra descrito en la literatura una ruta metabólica a través de la cual poder obtenerlo. Objetivos El objetivo principal de esta Tesis doctoral ha sido el diseño y ensamblaje de una ruta metabólica conducente a la producción del alcohol superior ramificado 2-etil-1-butanol, su introducción en el microorganismo modelo Escherichia coli y la demostración de su producción en el laboratorio. Para ello, se plantearon los siguientes subobjetivos: (i) Diseño teórico de la ruta metabólica de producción de 2-etil-1-butanol, evaluación y análisis del balance estequiométrico y redox de la ruta, análisis de flujos metabólicos y optimización teórica mediante predicción de posibles knockouts usando herramientas computacionales. (ii) Identificación y selección de enzimas candidatos para cada una de las reacciones de la ruta de síntesis y demostración experimental in vitro de su capacidad para utilizar los metabolitos implicados. (iii) Evolución dirigida de enzimas para crear aquellos pasos metabólicos para los cuales no se haya podido encontrar un enzima natural capaz de catalizar la reacción, cambiando la especificidad de sustrato de los enzimas seleccionados hacia los intermediarios de la ruta, para que puedan utilizar o generar el sustrato y producto deseado. (iv) Ensamblaje genético de la ruta metabólica, introducción en el microorganismo modelo E. coli y demostración experimental in vivo de la producción del producto objetivo 2-etil-1-butanol. Resumen iii Resultados y discusión En el primer capítulo de esta Tesis se diseñó y propuso la ruta metabólica conducente a la obtención de 2-etil-1-butanol, tomando como “modelo” de referencia la ruta natural de síntesis de 1-butanol de Clostridium sp. (Inui et al., 2008). La ruta sintética se compone de 10 reacciones enzimáticas (Fig 1.1). Las 4 reacciones iniciales coinciden con las correspondientes a la ruta de Clostridium generando butiril-CoA a partir de la condensación de 2 moléculas de acetil-CoA. Las 6 reacciones siguientes (que llamaremos pasos I al VI) son reacciones nuevas que conducen a la formación del producto ramificado. El primero de estos pasos metabólicos consiste en una condensación ramificada de butiril-CoA con acetil-CoA generando el producto 2-etil-acetoacetil-CoA. Los siguientes 5 pasos, corresponden a reacciones enzimáticas análogas a las que suceden en la ruta de producción de 1-butanol de Clostridium hasta generar el alcohol final, pero catalizadas sobre los correspondientes intermediarios metabólicos ramificados. El análisis estequiométrico de la ruta revela la capacidad teórica de producir 1 mol de 2-etil-1-butanol por cada 1.5 mol de glucosa (0.38 gramos de 2-etil-1-butanol por cada gramo de glucosa). En la ruta sintética no se produce ni consume energía en forma de ATP pero requiere el consumo de 12 moles de equivalentes de reducción (6 moléculas de NADH). La ruta utiliza selectivamente NADH como cofactor y se encuentra balanceada desde un punto de vista redox tanto en condiciones aerobias como anaeróbicas, ya que ese NADH consumido se balancea con el producido en el catabolismo de glucosa a acetil-CoA. Estos resultados son relevantes ya que indican que la producción de 2-etil-1-butanol es compatible con el crecimiento y mantenimiento celular (Fig 1.3). El análisis teórico de estereotopicidad de la ruta nos permitió identificar que los intermediarios metabólicos generados en los pasos metabólicos de la ruta I, II y III poseen centros quirales que generan esteroisómeros. Esto nos Resumen iv permitió anticipar y tener en cuenta la generación de posibles “dead-end metabolites” que podrían restar eficiencia a la ruta. Este resultado llevó a analizar posteriormente en detalle la estereoespecificidad de los enzimas correspondientes durante su evaluación experimental. El análisis teórico de especificidad de sustrato de la ruta, nos permitió identificar la aparición de posibles rutas metabólicas competitivas que generarían la producción de compuestos no deseados que restarían eficiencia a la producción de 2-etil-1-butanol (Fig 1.2). Por un lado, a partir del intermediario metabólico butiril-CoA se podría generar un sumidero metabólico hacia la producción de 1-butanol. Por otro lado, si la condensación catalizada en el paso I de la ruta entre butiril-CoA y acetil-CoA se produjera de manera lineal, se podría generar un sumidero metabólico hacia la producción de 1-hexanol. Debido a que la molécula objetivo 2-etil-1-butanol es un compuesto altamente reducido, su producción debería realizarse en condiciones aneróbicas. Esto permitiría aplicar estrategias para acoplar la producción con la supervivencia celular (Chubukov et al., 2018). En estas condiciones, menos carbono es utilizado en el crecimiento y mantenimiento celular y es redirigido a la formación de moléculas altamente reducidas capaces de regenerar el poder reductor y mantener la producción de energía. Por cada mol de 2-etil-1-butanol producido en condiciones anaeróbicas, el poder reductor regenerado, permitirían la producción de 3 mol de ATP en la glucólisis mediante fosforilación a nivel de sustrato. De los distintos resultados obtenidos mediante el análisis de ingeniería metabólica realizado (Tab 1.2), se eligieron para ser implementados aquellos que suponen un mayor beneficio y aquellos coherentes y alineados con trabajos previos similares. Las rutas seleccionadas para ser eliminadas mediante generación de “Knockouts” fueron las rutas de fermentación de E. coli (Clark, 1989) (ΔfrdB, ΔldhA, ΔadhE, Δpta) y el complejo enzimático transhidrogenasa (ΔpntA). Las rutas de fermentación compiten de manera directa con la ruta de Resumen v producción de 2-etil-1-butanol ya que son compuestos reducidos utilizados por E. coli para regenerar el poder reductor en condiciones anaeróbicas. El complejo transhidrogenasa es el encargado de mantener el balance de poder reductor mediante la reducción reversible NAD/NADP. Eliminando este complejo se evita el sumidero metabólico de NADH en forma de NADPH el cual no es utilizable por la ruta sintética. Finalmente, con el objetivo de incrementar el NADH intracelular, se seleccionó para ser introducido y sobreexpresado el gen de la enzima formato deshidrogenase (fdh) de Candida boidinii, que ha sido utilizada con el mismo propósito en estudios anteriores. (Claire R. Shen et al., 2011) En el segundo capítulo se seleccionaron y se analizó de manera experimental los candidatos enzimáticos para catalizar los pasos de la ruta sintética de producción de 2-etil-1-butanol (Fig. 2.1 y 2.2). A excepción del paso I (condensación ramificada acetil-CoA – butiril-CoA el cual está descrito en el Capítulo III). Basándonos en el concepto de la promiscuidad y versatilidad de las enzimas (Arora et al., 2014; Pirie et al., 2013) se seleccionaron 13 enzimas candidatas con actividades enzimáticas análogas a las de las enzimas correspondientes de la ruta de Clostridium, pero sobre las cuales existiera algún indicio que sugiriera que pudieran ser activas sobre los intermediarios ramificados correspondientes a la ruta de 2-etil-1-butanol. La estrategia seguida fue exitosa puesto que para todos los pasos metabólicos buscados se demostró experimentalmente que al menos uno de los candidatos era activo para cada uno de ellos (Paso II: PpFadB2. Paso III: PaCrt. Paso IV: TdTer. Paso V: PfAldh y Paso VI: LlAdh). Además, las enzimas PpFadB2, PaCrt y TdTer también pueden catalizar la síntesis de butiril-CoA. (Tab. 2.21). El hecho de que todos los enzimas seleccionados fueran capaces de utilizar tanto el sustrato natural como el ramificado plantea dos cuestiones. Por Resumen vi un lado, las 10 reacciones enzimáticas de la ruta sintética podrían ser catalizadas mediante solo 6 enzimas. Por otro lado, existe una alta probabilidad de que se generen sumideros metabólicos abriéndose las rutas competitivas conducentes a la generación de 1-butanol y 1-hexanol (Fig. 1.2). Los rendimientos de actividad obtenidos fueron relativamente altos excepto para los pasos enzimáticos III (PaCrt) y IV (TdTer) cuyos bajos rendimientos en la transformación del sustrato ramificado permite anticipar la presencia de cuellos de botella metabólicos (Tab. 2.21). Desde el punto de vista de la estereocompatibilidad de la ruta, el análisis in vitro realizado fue muy útil. Por un lado, permitió identificar que el sustrato sintetizado químicamente 3-hidroxi-2-etilbutiril-CoA consiste en una mezcla de dos diasteroisómeros en proporción 7:3, lo que permitió ajustar los rendimientos enzimáticos in vitro en consecuencia. Por otro lado, se demostró que la ruta es estereocompatible y no se generan estereoisómeros incompatibles que se acumulen. En el tercer capítulo, se seleccionaron y se analizó de manera experimental los candidatos enzimáticos para catalizar el paso clave de la ruta sintética, la condensación ramificada acetil-CoA con butiril-CoA conducente a la obtención de 2-etil-acetoacetil-CoA (Paso I). En este capítulo a través de un análisis exhaustivo de la superfamilia de enzimas tiolasa, se seleccionaron 8 posibles candidatos: 4 de la subfamilia de tiolasas degradativas Clase I (EC 2.3.1.16) BktB, AtoB, PpFadA, TtThl y 4 de la subfamilia de tiolasas biosintéticas Clase II (EC 2.3.1.9) PhaA, ACAT1, Erg10 y FbThl. Sorprendentemente en el análisis inicial in vitro, de las reacciones enzimáticas de los enzimas naturales, se detectaron cantidades traza del compuesto ramificado (cercanas al límite de detección de la técnica) en las reacciones catalizadas por las enzimas BktB y TtThl. Siendo superiores para BktB, Resumen vii esto permitió continuar el estudio a partir de una enzima con actividad enzimática basal. Con el fin de aumentar la actividad de condensación ramificada, se siguió una estrategia iterativa basada en evolución dirigida de enzimas guiada por estudios computacionales. A través del análisis in vitro de las distintas mutaciones que se iban introduciendo, se fue aumentando el rendimiento y selectividad hacia el producto ramificado (Fig. 3.1). En primer lugar, se realizó un estudio computacional sobre BktB en el que se identificaron 4 dianas potenciales de optimización en el centro activo (Leu89, Met290, Ile352 y Met379), correspondientes a residuos que podrían estar involucrados en la reacción de condensación ramificada. Aplicando métodos computacionales basados en Mecánica Cuántica y Molecular (QM/MM) y simulaciones de dinámicas moleculares (MD) se analizaron 4096 variantes virtuales de mutantes combinatorios de dichos residuos. De esta manera, se priorizaron 10 combinaciones de mutantes para ser producidas y analizadas experimentalmente en el laboratorio. Entre las variantes analizadas, solo el mutante triple BktB_Var10_L89I_M290A_M379V mostró un incremento de rendimiento hacia el producto ramificado, siendo este 6 veces superior a la enzima natural. La introducción de mutaciones homólogas en los otros candidatos tiolasa permitió que estos adquirieran la capacidad de generar los productos de las tres posibles condensaciones menos para FbThl_V97I_F298A_I387V (FbThl_Var10). AtoB_V87I_M289A_L378V (AtoB_Var10) y Erg10_V90I_F293A_I383V (Erg10_Var10) mostraron una actividad similar entre ellos y 4 veces superior a la de BktB_Var10. Por su lado, Erg10_Var10 mostró una mayor selectividad que AtoB_Var10 hacia el producto ramificado, por lo que fue seleccionada para continuar la evolución. Erg10_Var10 se sometió a un estudio de deconvolución en el que se identificó la posición F293 como el residuo esencial que confiere la capacidad Resumen viii de condensación ramificada al enzima. Con el fin de explorar sus posibilidades, se realizó un experimento de mutagénesis a saturación en el que se generaron los mutantes correspondientes a las 20 posibles mutaciones. Los resultados obtenidos permitieron identificar Erg10 F293D como el mejor mutante el cual presenta una selectividad hacia el producto ramificado del 58% y mantiene un 41% de la actividad enzimática de condensación acetil-CoA/acetil-CoA (actividad nativa). Con el objetivo de identificar si este resultado podría ser extrapolable a las otras tiolasas, mutantes homólogos a los dos mejores resultados F293D y F293A fueron implementados y analizados. Esto permitió identificar el mutante AtoB_M289A con una actividad hacia el producto ramificado similar a Erg10_F293D pero con menor selectividad. En el último capítulo de esta Tesis doctoral, los resultados obtenidos en los capítulos anteriores se implementaron sobre una cepa de E. coli K-12 BW25113, con el objetivo de conseguir una cepa de laboratorio productora y poder demostrar la funcionalidad de la ruta sintética de producción del compuesto 2-etil-1-butanol (Fig. 4.1.). En primer lugar, se mejoró la resistencia de E. coli hacia la molécula objetivo mediante la aplicación de la técnica de evolución adaptativa de laboratorio. De esta manera se incrementó la tolerancia de la cepa hacia el compuesto 2-etil-1-butanol a partir de una concentración inicial de 1 g/L hasta una concentración final de 4 g/L. La cepa evolucionada pasó a denominarse RPColi. En segundo lugar, la cepa evolucionada se lisogenizó con el fin de otorgarle la capacidad de reconocer los vectores de expresión basados en el promotor T7 y se implementaron las modificaciones metabólicas resultantes del análisis de ingeniería metabólica descrito en el Capítulo I (ΔfrdB, ΔldhA, ΔadhE, Δpta y ΔpntA). Además, se generaron distintas combinaciones de dichos knock-outs los cuales fueron caracterizados en el laboratorio. La cepa lisogénica con Resumen ix los 5 knock-outs fue seleccionada para albergar la ruta metabólica y paso a denominarse RPColi(DE3) Δ5. Por otro lado, con el fin de identificar la mejor combinación metabólica para la producción de 2-etil-1-butanol, se ensamblaron los genes de los distintos pasos metabólicos en vectores genéticos adecuados. Para ello, las mejores enzimas seleccionadas en el Capítulo II (PpFadB2, PaCrt, TdTer, PfAldh, LlAdh), se ensamblaron con distintas combinaciones de los genes de los enzimas obtenidos mediante evolución dirigida en el Capítulo III (Erg10_F293D, AtoB_M289A, Erg10_F293A). Además, algunas construcciones incorporaron el gen del enzima CbFDH y una tiolasa no evolucionada Erg10. Las construcciones genéticas fueron transformadas en la cepa RPColi(DE3) Δ5 para ser evaluadas. Los experimentos de fermentación realizados revelaron que la combinación genética con un mayor rendimiento en la producción de 2-etil-1-butanol es aquella que incluye la tiolasa evolucionada Erg10_F293A. La cepa final con mayor productividad pasó a denominarse Rpcoli (DE3) Δ5-p2E1B strain y posee la siguiente configuración genética: ΔldhA ΔadhE ΔfrdB ΔpntA Δpta pET28bmut-PfAldh-PpFadB2-PaCrt-Erg10_F293A pCDFDuet1-TdTer-LlAdh-Erg10. Entre los productos de fermentación detectados, se encontró 1-butanol en una concentración relativamente alta y 1-hexanol (642,8 ± 8,6 mg/L y 7,8 ± 0,7 mg/L respectivamente). Esto confirma la presencia de sumideros metabólicos e indica los siguientes pasos hacia los que dirigir la investigación para la optimización de la ruta. La concentración máxima alcanzada de 2-etil-1-butanol fue de 3,24 ± 1,11 mg/L. Aunque es una concentración modesta, permitió demostrar la funcionalidad de la ruta y la producción de este compuesto por primera vez mediante un proceso biológico. Así mismo, las tiolasas evolucionadas capaces de realizar condensaciones ramificadas generando ramificaciones etilo, abren la posibilidad de generar intermediarios metabólicos como el 2-etil-acetoacetil-CoA, los cuales pueden ser utilizados por Resumen x otras rutas metabólicas, como “building blocks” para la generación de otros compuestos con estructuras moleculares ramificadas novedosas, que podrían otorgarles propiedades diferenciales. Conclusiones  Se ha diseñado y construido una ruta metabólica sintética conducente a la producción del alcohol superior ramificado 2-etil-1-butanol, demostrando su funcionalidad in vivo en el microorganismo modelo E. coli, mediante la detección del compuesto de interés entre los productos de fermentación.  Por primera vez, una tiolasa ha sido evolucionada para sintetizar compuestos ramificados, obteniéndose de esta manera una nueva herramienta biotecnológica capaz de generar monómeros de alto interés para la generación de compuestos con propiedades diferenciales.  Se han identificado enzimas análogas a los distintos pasos metabólicos de la ruta de producción de 1-butanol de Clostridium, capaces de utilizar sustratos con estructura molecular ramificadas de 6 átomos de carbonos.  Se han obtenido por primera vez compuestos con ramificaciones etilo mediante una ruta metabólica sintética, los cuales son relativamente raros en la naturaleza. Esto incorpora la capacidad de generar este tipo de ramificación y abre la posibilidad a futuras investigaciones orientadas a la generación de estructuras ramificadas más complejas siguiendo una estrategia similar a la empleada.