Identificación de nuevos componentes en la ruta de transducción sensorial para la percepción de la luz en Phycomyces blakesleeanus

Resumen

Esta Tesis Doctoral se divide en tres capítulos que incluyen la caracterización del fotorreceptor WcoB, la identificación de MadC como una proteína reguladora de Ras que participa en la transducción de la señal luminosa y la confirmación de que CarC es una geranilgeranil pirofosfato sintasa que participa en el primer paso de la biosíntesis de β– caroteno, una de las rutas metabólicas reguladas por la luz en Phycomyces. En el primer capítulo investigamos el papel de WcoB en la fotobiología de Phycomyces abordando desde su transcripción hasta la interacción con proteínas carotenogénicas. Nuestros resultados muestran que el gen wcoB se transcribe levemente en luz con respecto a la oscuridad, ocurriendo lo mismo a nivel de proteína. Nosotros hemos investigado la localización de WcoB en el micelio de Phycomyces observándose dicha proteína en la fracción citoplasmática. Con el fin de conocer la función de WcoB y las proteínas con las que interacciona se realizaron inmunoprecipitaciones de proteínas usando un anticuerpo contra WcoB. Estos experimentos revelaron que WcoB interacciona con proteínas implicadas en la síntesis de β-caroteno como CarS, CarRA y HmgS, además de interaccionar con proteínas tipo WC. Esto resultados sugieren que el fotorreceptor WcoB podría tener un papel regulador sobre la actividad de estas enzimas en la biosíntesis de β-caroteno y su regulación por la luz. Por último, visualizamos las proteínas WcoB y CarS fusionadas con la proteína fluorescente GFP in vivo usando como sistema heterólogo el hongo Aspergillus nidulans. Además, confirmamos la interacción entre WcoB y CarS usando la técnica BiFC (Bimolecular Fluorescence Complementation) en Aspergillus. En el segundo capítulo identificamos el gen madC de P. blakesleeanus en colaboración con el laboratorio del Prof. Idrnum (Universidad Missouri-Kansas City, Kansas City, EEUU). La mutación en el gen madC disminuye la sensibilidad a la luz para el fototropismo del esporangióforo. Nuestros resultados han permitido identificar MadC como una GTPasa activadora de Ras. En los resultados obtenidos se confirmó la falta de un efecto significativo de la luz sobre la acumulación de ARNm del gen madC en la estirpe silvestre, al igual que en los mutantes del complejo Mad y los mutantes de los diferentes alelos del gen. Hemos investigado la regulación por la luz tanto del ARNm como de la proteína homóloga a MadC de Neurospora, conocida como IRA-1. Nuestros resultados indican que el gen ira-1 no es fotoinducible y la cantidad de proteína IRA-1 no varía con la luz. La localización celular de IRA-1 indica que es una proteína citoplasmática que debe interaccionar con Ras para regular su actividad. Además, su acumulación en los conidios sugiere un papel en la germinación y el crecimiento de la hifa. La identificación de MadC es un hito en la fotobiología de hongos que ha permitido identificar la primera proteína que participa en la cadena de transducción sensorial para el fototropismo después del receptor. Uno de los efectos más llamativos de la luz es la activación de la síntesis del pigmento anaranjado β–caroteno. La primera etapa de su biosíntesis está catalizada por la sintetasa de geranilgeranil pirofosfato (GGPPS). En el tercer capítulo de esta tesis demostramos que la mutación en el gen ggsA, responsable de una GGPPS, está ligada a la mutación carC. Además, hemos confirmado la actividad GGPPS de CarC y GgsB utilizando como sistema heterólogo de expresión la bacteria E. coli. Con el fin de conocer si el gen carC puede complementar la función del gen al-3 de N. crassa expresamos el ADNc del gen carC de P. blakesleeanus en un mutante al-3 de N. crassa. Nuestros resultados demuestran que el gen carC de P. blakesleeanus no complementa la mutación del gen al-3 de N. crassa, ya que los transformantes obtenidos producen la misma cantidad de carotenos que la estirpe no transformada. Nuestros resultados muestran que las mutaciones en el gen ggsA están ligadas al fenotipo de los mutantes carC, y confirmamos que ggsA es carC y que carC y ggsB codifican para proteínas con actividades GGPPS. Los resultados obtenidos durante la realización de esta Tesis Doctoral han permitido avanzar en el conocimiento de diferentes aspectos de las proteínas que usa Phycomyces para detectar la luz y regular su comportamiento y metabolismo.