MGRN1 como determinante de la integridad genómica y del fenotipo maligno de las células de melanoma

Resumo

Mahogunina (Mgrn1) es una E3-ubiquitina ligasa codificada por un gen cuyas mutaciones de pérdida de función dan lugar al ratón mahoganoide, caracterizado por un oscurecimiento del pelaje, neurodegeneración espongiforme y defectos cardiacos congénitos. Una de sus funciones conocidas es la regulación de la actividad del receptor de melanocortinas 1 (MC1R). El gen MC1R, el mayor determinante de la pigmentación cutánea y de la sensibilidad a la radiación ultravioleta, es muy polimórfico y algunas de sus variantes alélicas se asocian con melanoma. Además, da lugar a distintos transcritos, entre ellos una forma de ayuste alternativo, MC1R-203, con función desconocida. La influencia de Mgrn1 en la señalización del MC1R y su participación en tráfico endolisosomal, homeostasis mitocondrial, estrés oxidativo y orientación del huso mitótico, podrían contribuir al desarrollo de melanoma y/o a la modulación del fenotipo de los melanocitos malignos. Por ello, nos propusimos: i) caracterizar funcionalmente la isoforma MC1R-203, ii) estudiar el papel de Mgrn1 como modulador del fenotipo maligno en células de melanoma de ratón, iii) analizar el papel de MGRN1 como determinante de la agresividad del melanoma humano y iv) estudiar la base molecular de los efectos fenotípicos de MGRN1 en células de melanoma. Demostramos que MC1R-203 es minoritario respecto a la isoforma canónica (MC1R) en células HBL. Sin embargo, ambas isoformas presentaron una estabilidad intracelular similar en células HEK293T. Experimentos funcionales indicaron que MC1R-203 no estimuló eficientemente la vía del AMPc, pero activó normalmente la cascada de las ERK1/2. A diferencia de MC1R, MC1R-203 no indujo la ubiquitinación de β-arrestina-2 (ARRB2), una modificación dependiente de la formación de un complejo ternario MGRN1-MC1R-ARRB2, indicando que no actúa como andamiaje entre ARRB2 y MGRN1. El estudio de Mgrn1 como modulador del fenotipo en melanocitos (melan-a6) y células de melanoma (B16F10) de ratón indicó que la deficiencia de Mgrn1 (disminuida mediante silenciamiento génico transitorio con siRNA o anulada mediante CRISPR/Cas9) promueve un fenotipo caracterizado por mayor pigmentación, mayor número de dendritas y adhesión, menor movilidad celular y menor capacidad de colonización en pulmón. Además, mediante citometría de flujo observamos una progresión anómala del ciclo de células deficientes de Mgrn1, con mayor porcentaje de células en fase S, inestabilidad genómica y daño en ADN (evaluado principalmente mediante ensayos cometa). Estos resultados sugieren que Mgrn1 podría regular el fenotipo maligno y la integridad genómica de las células de melanoma murino. Para determinar si la expresión de MGRN1 podría actuar como factor pronóstico en pacientes de melanoma, analizamos datos públicos (TCGA) y muestras de pacientes junto con sus datos clínicos. Comprobamos que la expresión de MGRN1 es mayor en muestras de melanoma que en piel normal o nevi. Además, la incidencia de mutaciones en MGRN1 en muestras de melanoma es comparable a la de otros genes asociados a cáncer y una menor expresión de MGRN1 se asocia con mayor supervivencia. Estos resultados indican que MGRN1 podría ejercer un importante papel en la agresividad del melanoma humano. La base molecular de los efectos fenotípicos de MGRN1 se estudió en células de melanoma humano HBL. La depleción de MGRN1 alteró la progresión del ciclo celular y aumentó el daño en ADN. Mediante ensayos de hebra de ADN, comprobamos que la ausencia de MGRN1 incrementó el estrés replicativo, con aumento de horquillas de replicación atascadas y deficiente activación del eje ATR-CHK1. Ensayos de inmunoprecipitación de MGRN1 y aproximaciones proteómicas mostraron su interacción con CDK2 y RPA1. La ausencia de MGRN1 disminuyó los niveles de CDK2, y experimentos de inhibición selectiva de esta quinasa sugirieron que la interacción MGRN1-CDK2 contribuye a la respuesta normal al estrés replicativo al participar en la activación correcta del eje ATR-CHK1