Characterization of the structure and function of the Rabphilin 3A

Resumen

En el desarrollo de esta Tesis Doctoral se han caracterizado estructural y funcionalmente los dominios C2 de la Rabfilina 3A. Esta proteína contiene dos dominios C2, C2A y C2B dispuestos en tándem y existen evidencias de su participación en el proceso de exocitosis y fusión vesicular a través de su capacidad de interaccionar con el complejo SNARE. Esta proteína controla el proceso de recaptación de nuevas vesículas, siendo la interacción con el SNAP25 un paso regulador clave. Los estudios bioquímicos y biofísicos han demostrado que cada uno de los dominios C2 presentan un modo diferente de unión a calcio, así como diferentes afinidades por los fosfoinosítidos, lo que podría implicar una diferencia en la regulación de la transmisión sináptica y los procesos de secreción de vesículas. El comportamiento en tándem de los dominios C2AB de rabfilina 3A presenta un comportamiento característico que se ha estudiado mediante técnicas biofísicas, bioquímicas y de biología molecular. Mediante el estudio de la proteína silvestre y el desarrollo de construcciones mutantes se ha caracterizado el modo de unión de esta proteína a la membrana y al complejo SNARE. Mediante calorimetría de titulación isotérmica (ITC) se ha determinado que el dominio C2A de rabfilina 3A se une principalmente a la membrana formadas por POPC/POPS/PI(4,5)P2 por la región rica en lisinas del dominio. El aumento de calcio en el sistema permite anclar al dominio por otra zona del mismo, la región de unión a calcio. Los puntos de unión del dominio C2B permanecen bloqueados por la disposición relativa de ambos dominios, quedando accesible la hélice H2, principal zona por la que la proteína es capaz de interaccionar con el complejo SNARE. El dominio C2AB de rabfilina 3A no es capaz de formar agregados por si sólo, pero la presencia de vesículas formadas por fosfolípidos permite que los dominios de la proteína se unan de forma dependiente de calcio a dos membranas acercando a ambas observándose un aumento en el tamaño de los agregados cuando son estudiados mediante dispersión dinámica de la luz (DLS). Con microscopía electrónica de transmisión se ha corroborado el tamaño de estos agregados visualizándose la potencial capacidad de fusión de vesículas. Mediante mutaciones se ha determinado que la zona del conector entre ambos dominios podría actuar como freno de la capacidad de agregación, porque cuando los residuos son mutados la capacidad de agregación se ve aumentada de manera significativa. Otro punto de control en la capacidad de formar agregados se encuentra en los lazos de unión a calcio del dominio C2A, actuando como punto de control positivo de la unión del dominio a la membrana. La obtención de la estructura cristalina del dominio C2B de rabfilina con SNAP25 ha permitido determinar los residuos clave en la interacción. Mediante la combinación de diferentes técnicas bioquímicas y biofísicas se ha propuesto que los dominios C2AB dispuestos en tándem son capaces de coordinar calcio y PI(4,5)P2 por la zona de unión a calcio y de la región rica en lisinas; mientras que se une al SNAP25 a través de la hélice H2 del dominio C2B. Se ha determinado que la interacción entre C2AB de rabfilina 3A y SNAP25 ocurría también con los complejos SNAP25/STX1A y SNAP25/STX1A/VAMP2. Esta unión es dependiente de calcio y precisa del dominio completo para que tenga lugar esta interacción. Con todos estos resultados se propone un modelo que trata de explicar cómo la rabfilina 3A participa en el proceso de fusión vesicular con la cooperación de calcio y PI(4,5)P2.